《Advanced Science》：Defect-Rich 2D Layered Double Hydroxides Enhance Sonodynamic Antibacterial Therapy
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本文报道了一种通过温和酸蚀构建富含氧空位（OVs）的缺陷富集二维DR-ZnCuW-LDH纳米片（DR-ZnCuW-LDH nanosheets）的策略。该材料在超声（US）激发下，通过晶体-多晶相变、能带隙（Eg）窄化（从3.29 eV降至1.80 eV）显著促进电子-空穴（e?-h+）分离，使单线态氧（1O2）生成量提升约4倍。体外和体内实验证实，其声动力疗法（SDT）能有效清除耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa），破坏生物膜，并加速感染伤口和细菌性角膜炎的愈合，展现出优异的生物相容性，为对抗耐药菌感染提供了新平台。
引言
细菌感染，尤其是由多重耐药（MDR）甚至泛耐药菌株引起的感染，已成为全球重大健康威胁，而有效新抗生素的研发管线极为有限。生物膜介导的深部组织持续性感染由于药物渗透性差，常对传统疗法产生抵抗。基于活性氧（ROS）的策略作为有前景的非抗生素替代方案，可 indiscriminately 诱导细菌脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤，而非针对单一分子靶点。这种多位点损伤机制使ROS能够有效根除耐药菌，同时大大降低诱导额外耐药性的可能性。
声动力疗法（SDT）最初为肿瘤治疗开发，现越来越多地被认为是治疗细菌感染的一种非侵入性方法。尽管一些声敏剂可能缺乏主动的生物靶向配体，但SDT的安全性由超声（US）的高空间分辨率固有地保证。ROS的产生严格限制在US照射的局部区域，即使没有特定的分子靶向，也能确保周围正常组织不受影响。与光触发治疗策略如光动力疗法（PDT）和光热疗法（PTT）相比，SDT提供更深的组织穿透能力，能够靶向、非侵入性地治疗深部或广泛感染。在US激活下，声敏剂产生ROS以根除细菌。与传统抗生素不同，SDT具有精确的空间靶向性、最小的全身副作用以及由于局部ROS产生而具有较低的耐药性倾向。
尽管有机声敏剂显示出治疗潜力，但它们通常存在生物利用度有限、化学稳定性差和清除快的问题。相比之下，无机声敏剂具有更高的化学和热稳定性以及优异的声学特性，使其对SDT具有吸引力。然而，它们固有的宽带隙（Eg）严重限制了在US激发下的电子（e?）-空穴（h+）分离效率，导致ROS产率欠佳和SDT性能受限。因此，设计具有增强电荷分离和更窄带隙的新型无机声敏剂对于高效ROS生成至关重要。
减少无机声敏剂的带隙、增加其表面积以及增强e?-h+的有效质量都有助于改善电荷分离和SDT效率。构建异质结构、掺杂其他元素以及引入氧空位（OVs）缺陷等策略被广泛用于通过捕获声激活电子来抑制快速电荷复合。氧缺陷工程已显得特别有效，可作为局部电子库，延长载流子寿命并调节界面氧化还原动力学。传统的OVs制备方法可能导致结构损伤、颗粒粗化、损害生物相容性和胶体分散性。相比之下，酸蚀刻可以在温和条件下引入缺陷，并已在基于LDH的系统中用于增强光热/化学疗法。然而，用于声动力抗菌治疗的具有优化缺陷构型的高效无机声敏剂仍然稀缺。
二维层状双氢氧化物（LDHs）由于其独特的层状结构和可调的化学组成而引起了广泛兴趣。LDHs通常由排列在类水镁石层中的二价和三价金属离子组成，并具有一个可以容纳各种功能分子或客体离子的层间区域。LDHs已被证明是有前景的纳米载体，具有优异的生物相容性、酸响应生物降解性以及多样化的化学组成和结构。它们被广泛应用于药物递送、纳米酶和传感器。然而，将2D LDHs用作声动力抗菌治疗的声敏剂仍然是一个显著的知识空白。
本研究报道了一种基于温和酸蚀的缺陷工程策略，用于构建富含缺陷的DR-ZnCuW-LDH纳米片，该纳米片经历晶体到多晶的相变，形成丰富的OVs，减小带隙Eg，从而促进e?-h+分离。
结果与讨论
制备与表征
通过低温水热法合成了超薄2D ZnCuW-LDH纳米片。透射电子显微镜（TEM）图像显示ZnCuW-LDH纳米片呈板状形态，尺寸约为100–105 nm。能量色散X射线（EDX）元素 mapping 显示Zn、Cu和W在单个纳米片上均匀分布。原子力显微镜（AFM）高度剖面进一步突出了超薄特性，厚度约为8.0 - 9.0 nm。X射线衍射（XRD）图谱显示ZnCuW-LDH在2θ = 11.52°和24.12°处有特征衍射峰，对应于（003）和（006）晶面，证实了其层状结构和良好的结晶度。通过酸蚀处理，ZnCuW-LDH纳米片的晶体结构可以转变为DR-ZnCuW-LDH纳米片。DR-ZnCuW-LDH的XRD图谱显示典型衍射峰消失。两种纳米片均具有良好的稳定性，至少可稳定存在7天。在模拟生理流体中监测两周，其流体动力学直径未发生明显变化，表明具有优异的胶体稳定性。DR-ZnCuW-LDH纳米片的TEM图像显示其保持了ZnCuW-LDH纳米片的2D结构，但尺寸略微减小至80–100 nm。AFM高度剖面显示其厚度与ZnCuW-LDH纳米片相比变化可忽略不计，约为8.0 - 9.0 nm。扫描透射电子显微镜（STEM）图像表明ZnCuW-LDH纳米片显示单晶结构，而DR-ZnCuW-LDH纳米片（图1F）则无明显晶格条纹，证明其非晶/多晶性质。原子分辨率STEM图像（图1G）进一步证实了其多晶性质。
傅里叶变换红外（FT-IR）光谱用于研究ZnCuW-LDH和DR-ZnCuW-LDH纳米片的结构特性和官能团。在3400和1386 cm?1处出现的吸收带分别归属于羟基（O-H）的伸缩振动和C=O（CO32?），证明了ZnCuW-LDH的成功合成。酸蚀对LDH结构影响甚微。X射线光电子能谱（XPS）用于进一步研究ZnCuW-LDH和DR-ZnCuW-LDH纳米片的元素组成和化学状态。survey谱中均观察到Zn、Cu、W和O的峰。在Zn 2p XPS谱中，ZnCuW-LDH纳米片中726.38和712.88 eV处的峰对应于Zn2+2p3/2和2p1/2，表明Zn2+的存在。蚀刻前后结合能基本不变，表明蚀刻过程对Zn元素影响最小。在ZnCuW-LDH的Cu 2p XPS谱中，934.0和954.1 eV处的峰归属于Cu2+。相比之下，DR-ZnCuW-LDH的Cu 2p谱在953 eV处出现新的结合峰，可归属于Cu+，表明Cu2+部分还原为Cu+。这种还原是由于氧空位（源于氧原子的损失）在酸蚀过程中有效降低了纳米片层中高价金属离子的氧化态。ZnCuW-LDH纳米片的高分辨率XPS W 4f谱显示在35.41和37.57 eV处有两个峰，分别对应于W4f5/2和W4f7/2。与ZnCuW-LDH纳米片相比，DR-ZnCuW-LDH纳米片在37.64和35.54 eV处出现两个额外的峰，与W5+4f5/2和W5+4f7/2相关，表明在酸蚀过程中六价钨（W6+）部分还原为五价钨（W5+）。这些结果证明蚀刻过程有效诱导了氧空位（OVs）的形成并改变了Cu和W元素的价态。
O 1s区域的XPS分析进一步证实了ZnCuW-LDH和DR-ZnCuW-LDH纳米片中不同氧物种的存在。具体而言，ZnCuW-LDH纳米片中530.78和532.91 eV处的结合能分别对应于晶格氧（OL）和吸附氧（OS）。然而，与ZnCuW-LDH纳米片相比，DR-ZnCuW-LDH纳米片在531.71 eV处出现一个新峰，这归因于大量氧空位（OVs）的形成。因此，可以推断酸蚀过程是一种有效、直接的方法，可促进2D ZnCuW-LDH纳米片从晶体相向缺陷相的转变。此外，ESR谱表明DR-ZnCuW-LDH纳米片在g = 2.2处显示出比ZnCuW-LDH纳米片更强的信号，表明酸蚀引入了大量缺陷。
SDT性能
为了研究缺陷工程对DR-ZnCuW-LDH纳米片SDT性能的影响，系统研究了其声动力性能。使用单线态氧传感器绿色（SOSG）荧光探针作为ROS捕获剂，优化了蚀刻条件（pH值、蚀刻时间、Cu掺杂比例）。最终选择pH 4.0下蚀刻4小时、Cu掺杂比例为5%的ZnCuW-LDH纳米片进行后续实验。在US照射（1 MHz, 1.0 W cm?2, 5 min）下，DR-ZnCuW-LDH纳米片显示出更强的DCFH-DA荧光强度，其活性比ZnCuW-LDH纳米片高约3.7倍。
使用SOSG和1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）监测DR-ZnCuW-LDH纳米片的1O2生成。DR-ZnCuW-LDH纳米片表现出比ZnCuW-LDH纳米片强约4倍的ROS生成性能。含有DR-ZnCuW-LDH纳米片的DPBF的紫外-可见-近红外（UV-vis-NIR）吸收光谱（300–480 nm）随着US照射时间的延长而迅速下降，而含有ZnCuW-LDH纳米片的DPBF吸收光谱在US照射下仅显示微小变化，表明DR-ZnCuW-LDH具有强大的1O2生成能力。此外，使用电子自旋共振（ESR）光谱通过2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮（TEMP）监测单线态氧（1O2）的产生。在超声照射（1 MHz, 1.0 W cm?2, 5 min）后，在DR-ZnCuW-LDH组中观察到明显的1O2特征1:1:1信号。未检测到对应于羟基自由基（·OH）的1:2:2:1信号，表明未生成其他活性氧物种。
为了更深入了解US介导的ROS生成机制，使用UV-vis-NIR光谱检查了ZnCuW-LDH和DR-ZnCuW-LDH纳米片的能带结构。ZnCuW-LDH和DR-ZnCuW-LDH纳米片的带隙（Eg）分别为3.29和1.8 eV。通过Mott-Schottky图确定了它们的导带（CB）位置，DR-ZnCuW-LDH和ZnCuW-LDH的CB电位分别为-1.19 eV和-0.76 eV。因此，相关的价带（VB）电位分别确定为ZnCuW-LDH为2.53 eV，DR-ZnCuW-LDH纳米片为0.61 eV。基于这些发现，清晰地说明了ZnCuW-LDH和DR-ZnCuW-LDH纳米片的能带结构。DR-ZnCuW-LDH纳米片能够在US照射下实现e?-h+对的有效激发和分离。与ZnCuW-LDH纳米片相比，DR-ZnCuW-LDH纳米片具有更低的Eg，使其更易被激发并促进电荷载流子分离，h+占据VB，e?驻留在CB。e?和h+分别位于CB和VB，超声波产生的电子被释放到周围环境中，与O2反应形成中间物种·O2?。随后，·O2?与h+结合产生最终产物1O2。使用二氢罗丹明123（DHR 123）探针证实了·O2?的产生，该探针在与·O2?反应时在525 nm处发出荧光信号。在超声照射下，存在ZnCuW-LDH纳米片时检测到微弱的DHR 123荧光信号，而存在DR-ZnCuW-LDH纳米片时观察到强烈的荧光信号，表明这些纳米片的e?和h+分离效率增强。
谷胱甘肽（GSH）耗竭通过加剧氧化应激、持续炎症失调和损害组织修复所必需的细胞过程，深刻影响感染组织愈合的病理生理学。使用DTNB（5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸））探针在412 nm处的吸收峰来反映GSH耗竭。在US刺激5分钟或10分钟后，DR-ZnCuW-LDH纳米片能有效降低DTNB的吸收，并随时间持续降低。根据统计数据，DR-ZnCuW-LDH纳米片的US处理在约10分钟内减少了GSH消耗，并显示出明显的时间依赖性效应。因此，DR-ZnCuW-LDH纳米片可能代表一种有前景的治疗途径，可改善感染引起的组织破坏并促进有效的伤口闭合。
体外抗菌和抗生物膜性能
受DR-ZnCuW-LDH纳米片优异的ROS生成能力和US刺激下的声动力特性的鼓舞，进一步评估了其潜在的抗菌活性。为了评估US激活的DR-ZnCuW-LDH纳米片的抗菌效果，进行了一系列实验来评估细菌活力、生物膜破坏和细菌细胞的结构变化。选择最具代表性的革兰氏阳性菌株MRSA和革兰氏阴性菌株铜绿假单胞菌作为模型细菌进行后续研究。材料的生物相容性是其潜在生物应用的关键因素。在不同材料浓度下共培养两小时后，使用稀释涂布法分析，结果表明浓度为100 μg mL?1的纳米片对MRSA和铜绿假单胞菌没有表现出显著的毒副作用。即使在200 μg mL?1的浓度下，细菌存活率仍保持在80%。此外，通过在不同时间点测量光密度（OD = 600）绘制细菌生长曲线，进一步证实DR-ZnCuW-LDH纳米片与MRSA和铜绿假单胞菌具有良好的生物相容性。在US刺激下，DR-ZnCuW-LDH纳米片溶液（50 μg mL?1）可以释放1O2，从而对抗细菌达到抗菌效果。在US（1.0 MHz, 1.0 W cm?2）处理5分钟后，MRSA和铜绿假单胞菌的菌落数显著下降至16.09%和23.4%。值得注意的是，DR-ZnCuW-LDH + US组在US和激光照射处理10分钟后，对铜绿假单胞菌和MRSA均表现出近乎100%的杀菌效果。
此外，使用扫描电子显微镜（SEM）检查了MRSA的形态变化。PBS（I）、PBS + US 5分钟（II）和PBS + US 10分钟（III）组保持了完整的球形形态，细胞膜光滑完整，即使在US后也未观察到可见损伤。然而，经DR-ZnCuW-LDH溶液（50 μg mL?1）处理并在US照射后的MRSA表面显示出不同程度的膜皱缩和结构破坏，其中损伤最为明显。这些发现进一步证实了DR-ZnCuW-LDH纳米片优异的声动力抗菌特性。为了进一步确认细菌活力，使用SYTO-9和碘化丙啶（PI）进行活/死染色。PBS（I）、PBS + US 5分钟（II）和PBS + US 10分钟（III）组显示主要为绿色荧光，表明细菌存活。相比之下，DR-ZnCuW-LDH + US 5分钟（V）和ZnCuW-LDH + US 10分钟（VI）组显示红色荧光显著增加，表明细菌膜损伤和细胞死亡。这些发现与SEM结果一致，并进一步验证了治疗的有效性。
细菌生物膜导致了超过60%的人类传染病，并在细菌粘附和生长中起着至关重要的作用。MRSA生物膜是由细胞外聚合物（如多糖、蛋白质和核酸）组成的复杂结构。这些结构保护细菌免受宿主免疫反应的影响，并阻碍抗菌剂的有效渗透。此外，由于细胞外聚合物（EPS）的保护，生物膜可以防止抗生素的渗透，从而降低其抗菌活性。使用结晶紫染色评估了DR-ZnCuW-LDH纳米片破坏生物膜的能力。与PBS + US（II）相比，在US刺激5分钟（1 MHz, 1.0 W cm?2）下，DR-ZnCuW-LDH + US组（V）中MRSA和铜绿假单胞菌的生物膜生物量分别减少了约1.82倍和2.47倍。此外，DR-ZnCuW-LDH + US组（VI）在US照射10分钟后可以进一步增强生物膜破坏。定量分析显示，DR-ZnCuW-LDH + US组实现了超过90%的生物膜生物量减少，突出了其卓越的生物膜破坏能力。使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）在三维空间中观察生物膜结构和细菌活力。PBS（I）、PBS + US 5分钟（II）和PBS + US 10分钟（III）组显示出致密均匀的生物膜结构，主要为活菌（绿色荧光）。相比之下，DR-ZnCuW-LDH + US组（VI）显示出被破坏的生物膜结构，死菌（红色荧光）显著增加并出现明显的孔洞。合并图像进一步证实了治疗有效破坏了生物膜并杀死了细菌。DR-ZnCuW-LDH纳米片在US刺激下可以释放ROS，可用于化学降解生物膜的EPS并促进抗菌活性。结果表明，当被US激活时，DR-ZnCuW-LDH纳米片表现出有效的抗菌和生物膜破坏作用。DR-ZnCuW-LDH纳米片和超声之间的协同相互作用导致显著的细菌细胞损伤、生物膜破坏和细菌活力显著降低。这些发现突出了DR-ZnCuW-LDH纳米片作为对抗细菌感染和生物膜相关疾病的新颖有效策略的潜力。
为了描述DR-ZnCuW-LDH纳米片如何将触发的ROS转化为细菌损伤，在相同条件下量化了MRSA和铜绿假单胞菌的细胞内氧化负荷和膜功能。使用DCFH-DA的共聚焦成像显示，与PBS、单独US或单独纳米片相比，DR-ZnCuW-LDH + US组的细胞内ROS显著增加，并且从5分钟到10分钟具有明显的暴露时间依赖性。一致地，采用3,3'-二丙基硫二碳菁碘化物（DiSC3(5)）测定法评估不同处理后细菌膜电位的变化。亲脂性DiSC3(5)在细菌膜的磷脂双分子层内聚集，在PBS和单一处理对照中导致染料自淬灭。然而，DR-ZnCuW-LDH + US组的处理使细菌膜去极化，破坏了膜电位，导致DiSC3(5)释放并增强上清液中的荧光。此外，邻硝基苯基-β-D-半乳糖吡喃糖苷（ONPG）水解显示DR-ZnCuW-LDH + US处理后膜通透性增加，表明包膜屏障受损。如图3C和图S13C所示，DR-ZnCuW-LDH + US 10分钟组中细菌的原始形态被严重破坏，膜明显收缩和起皱，导致细菌内容物释放。进行细菌蛋白泄漏测定以进一步评估膜完整性的丧失。总之，这些结果建立了一个级联反应：US激活的DR-ZnCuW-LDH纳米片升高细胞内氧化应激，使膜电位崩溃，增加通透性，诱导细胞内内容物泄漏，并导致细菌直接死亡。
体内伤口愈合抗感染治疗
受体外抗菌试验有希望结果的推动，进行了进一步研究以评估DR-ZnCuW-LDH纳米片的治疗潜力。使用CCK-8测定在L929和HCEC细胞系上评估了DR-ZnCuW-LDH纳米片的细胞毒性效应。DR-ZnCuW-LDH纳米片表现出最小的细胞毒性。即使在高浓度（150 μg mL?1）下共孵育24小时后，细胞活力仍保持在85%以上。考虑到其优异的ROS生成能力和声动力特性，DR-ZnCuW-LDH纳米片显示出作为体内高效声动力抗菌治疗纳米材料的巨大潜力。
为了验证SDT在涉及组织屏障的临床相关场景中的疗效，我们特意选择了模拟深部或复杂感染的皮下脓肿模型和细菌性角膜炎模型，这些模型涉及模拟复杂感染的多层组织结构。采用通过局部注射MRSA诱导的小鼠皮下脓肿模型来评估SDT疗效和伤口修复。将小鼠分为4个不同组：PBS（I）、DR-ZnCuW-LDH（II）、US（III）和DR-ZnCuW-LDH+US（IV）。在10天治疗期间MRSA感染脓肿的照片显示，用DR-ZnCuW-LDH+US（IV）治疗的小鼠表现出最显著的恢复，瘢痕大小随时间逐渐减小。到第10天，PBS（I）组未观察到显著改善，显示持续分泌和脓液渗漏，表明伤口感染严重。DR-ZnCuW-LDH（II）和US（III）组显示中度伤口愈合，伴有残余瘢痕。值得注意的是，DR-ZnCuW-LDH+US（IV）组恢复最快，到第10天瘢痕完全消退，这归因于声动力疗法促进的ROS生成，突出了其治疗潜力。此外，随时间推移体重没有明显变化表明治疗是安全的。
通过量化第3天从脓肿提取的组织在琼脂平板上的细菌菌落形成单位（CFUs）进一步评估了DR-ZnCuW-LDH+US的抗菌性能。在DR-ZnCuW-LDH+US（IV）组的样本中观察到极少的细菌生长，与体外抗菌测定结果一致。在第10天使用苏木精和伊红（H&E）染色对感染皮肤组织进行组织学分析。注释了关键组织学特征，包括完整表皮（绿色箭头）、炎症细胞浸润（红色箭头）和新血管形成（黄色箭头）。在PBS（I）组中观察到严重的炎症细胞浸润和表皮增厚。DR-ZnCuW-LDH（II）和US（III）组显示中度改善，而DR-ZnCuW-LDH+US（IV）组表现出最完整的表皮、炎症细胞浸润显著减少以及血管生成增强，包括新毛囊的形成。革兰氏染色结果进一步证实感染在PBS（I）、DR-ZnCuW-LDH（II）和US（III）组中持续存在，观察到广泛的革兰氏阳性区域，尤其是在PBS（I）组中。Masson三色染色显示，蓝色胶原纤维沉积在DR-ZnCuW-LDH+US（IV）组中最显著。此外，PBS（I）、DR-ZnCuW-LDH（II）、US（III）和DR-ZnCuW-LDH+US（IV）组的胶原沉积分别为6.55% ± 0.86, 6.96% ± 1.11, 11.44 % ± 1.21, 36.84 % ± 1.71。这些发现突出了DR-ZnCuW-LDH纳米片作为声动力抗菌治疗和伤口愈合有效材料的潜力。
对iNOS（M1巨噬细胞极化期间高表达的标志物）的免疫组织化学染色有助于炎症介质的释放。用PBS（I）处理的皮肤组织显示出大量的M1型巨噬细胞浸润（通过广泛的棕色染色表明），证实了严重的炎症反应（9.55% ± 3.51）。用DR-ZnCuW-LDH（II）或US（III）处理导致炎症表达减少，表明炎症反应强度减弱但持续存在（分别为17.86% ± 0.8和15.36% ± 1.82）。用DR-ZnCuW-LDH+US（IV）处理后，皮肤组织中的iNOS水平显著降低至6.50% ± 1.92，表明DR-ZnCuW-LDH+US有效减轻了感染组织的炎症并促进了伤口愈合。类似地，Arg1（一种M2型巨噬细胞标志物）显示PBS（I）组中有一小群密集分布的M2型巨噬细胞，表明炎症反应明显（4.18% ± 1.48）。相比之下，DR-ZnCuW-LDH（II）和US（III）组显示炎症细胞存在减少，表明炎症状态严重程度降低但持续存在（分别为8.26% ± 1.29和7.99% ± 1.27）。值得注意的是，用DR-ZnCuW-LDH+US（IV）处理显著增加了皮肤组织中的Arg1水平至33.10% ± 2.36，证明DR-ZnCuW-LDH+US不仅减轻了感染组织的炎症反应，而且有效促进了伤口愈合。这些发现共同强调了DR-ZnCuW-LDH纳米片作为声动力抗菌治疗和加速伤口愈合的有前景材料的潜力。
体内细菌性角膜炎的治疗评估
抗菌动力疗法主要分为外源性和内源性两类。外源性治疗主要包括PDT和SDT。其中，PDT是目前研
