《Journal of Hazardous Materials》：Effects of Earthworms on Soil Virus-Associated ARGs and Resistance Phenotypes in Long-Term Field Cropping Systems
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长期田间条件下蚯蚓通过宏基因组学与病毒组学分析，发现其抑制病毒相关及高风险抗性基因，改变微生物生命策略，稳定病毒宿主网络，起生态过滤器作用，为One Health框架提供抗性风险管理依据。
丁颖|刘博文|吴迪|李洪哲|杜帅|朱东
中国南京农业大学资源与环境科学学院土壤生态实验室，南京210095
摘要
在现实的田间条件下，蚯蚓对土壤抗性组的长期影响仍知之甚少。在此，我们在2018年建立的长期田间实验中进行了为期两年的玉米-小麦轮作研究，以系统地探讨一次性添加蚯蚓如何持久地调节抗性组。整合的宏基因组学和病毒组学分析显示，根际中的抗生素抗性基因（ARGs）和毒力因子基因（VFGs）数量始终高于土壤主体，这表明根际是抗性传播的热点区域。尽管宏基因组学变化有限，但长期蚯蚓活动抑制了与病毒相关的ARGs和VFGs以及高风险ARGs，尤其是在土壤主体中。值得注意的是，根际中的表型抗性在第一年显著增加（环丙沙星处理组增加了38.9%，美罗培南处理组增加了31.3%），而没有伴随基因型变化；而显著的基因型变化仅在第二年出现，这表明表型抗性先于基因型变化。长期添加蚯蚓改变了微生物的生活史策略，从R-策略转变为K-策略，并在整个两年作物轮作期间增强了溶原体的比例（占病毒组的72.73–85.05%），同时稳定了病毒-宿主网络。Caudovirales病毒感染链霉菌和假单胞菌，成为连接ARGs与养分循环微生物的枢纽，蚯蚓增强了跨界的合作相互作用。这些发现突显了蚯蚓在微生物适应性和抗性组动态中的长期调节作用，为“同一健康”框架下的抗性风险管理提供了依据。
引言
与广泛的人类活动（如污水/废水灌溉和有机肥料施用）相关的抗生素抗性基因（ARGs）长期以来一直是研究的主要焦点，并已成为全球性问题，对公共卫生构成日益严重的威胁[1]、[2]、[3]、[4]。这些活动将多样且丰富的ARGs引入了可耕地土壤，导致它们随后转移到更广泛的农业环境中并在作物植物中积累[1]、[2]、[4]。许多研究表明，蚯蚓作为关键的生态系统工程师，在推动元素循环、调节细菌群落和减轻土壤中ARGs相关风险方面发挥着重要作用，这主要通过受控实验室微宇宙实验得到证实[5]、[6]、[7]。然而，迄今为止的大多数研究都来自短期实验室微宇宙或盆栽实验[6]、[8]、[9]，通常只在受控条件下持续几周到几个月。这些研究主要捕捉了蚯蚓的即时效应，缺乏关于其在实际田间条件下（尤其是在多样化的作物轮作系统中）对ARGs动态的长期影响的可靠证据。这代表了理解蚯蚓驱动的生物扰动如何影响实际农业生态系统中ARGs长期持续性和命运的关键知识空白。
病毒介导的ARGs水平转移（HGT）也是细菌获得抗生素抗性的关键途径[10]、[11]、[12]、[13]。作为ARGs的主要储存库[10]、[14]，病毒不仅通过捕食和感染期间重新编程宿主代谢来调节微生物数量，还通过宿主细胞裂解促进养分释放[12]、[15]、[16]。因此，它们在陆地生态系统中发挥着基础性作用，深刻影响生态系统功能、生物地球化学循环（例如养分周转、能量流动和食物网动态）、微生物进化过程以及碳代谢[10]、[12]、[14]、[15]。多项研究表明，病毒可以在各种环境中携带ARGs[14]、[17]、[18]。最近，Gu等人报告称，在水稻土壤（RS）和旱地土壤（CS）中，分别有9.61%和11.4%的土壤病毒携带至少一种具有多宿主感染性的ARG[11]。Wang等人证实，某些噬菌体种类（主要是和）可以携带和转移特定的ARGs，对人类健康构成相当大的风险，尤其是在与人类相关的栖息地中[19]。尽管病毒组和与病毒相关的ARGs普遍存在且具有生态重要性，但在长期田间作物系统中，尤其是在蚯蚓存在的情况下，它们仍然研究不足。蚯蚓在调节土壤病毒群落和与病毒相关的ARGs方面的长期作用仍很大程度上未知，这代表了评估病毒介导的抗性传播及其生态和“同一健康”相关风险的关键知识空白。
根际及其微生物对植物健康和可持续农业至关重要[16]、[20]。根际在微生物群落和物理化学性质（包括pH值、养分可用性和氧化还原状态）方面与周围的土壤主体不同[16]、[21]。作为一个富含养分的微生境，根际具有分类学和功能上多样的微生物组，这些微生物组与植物根系进行密集的相互作用[20]、[21]。通过根系分泌物和信号化合物，植物积极调节微生物组成，从而招募适应其功能和生理需求的根际微生物组[21]。此外，与土壤主体相比，根际作为植物-土壤界面处的狭窄区域，受到根系分泌物和植物黏液沉积的影响[21]、[22]，具有独特的抗性组特征，其细菌群落维持着相对较大的ARGs库[23]。越来越多的证据表明，植物根际是土壤生态系统中HGT和ARBs传播的关键热点[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。这主要是由于该区域细胞聚集的可能性较高、细菌代谢活动增强以及细菌和移动遗传元件（MGEs）的移动性增加[22]、[25]。这些条件可能促进了ARGs从土壤主体向根际群落的迁移，随后它们可以转移到与植物相关的细菌中，包括内生和叶际微生物组[23]，最终通过食物链进入人体[24]。然而，在长期田间作物轮作系统中，特别是在蚯蚓存在的情况下，ARGs或ARBs以及病毒介导的ARGs在作物根际中的持久性尚未得到充分研究。此外，很少有研究评估作物根际带来的潜在ARG风险。需要进一步研究长期作物根际条件下的细菌和病毒群落中的ARG风险之间的关联[23]。在这项研究中，我们使用玉米-小麦轮作系统进行了为期两年的田间规模实验，利用Illumina测序技术进行了宏基因组学和病毒组学分析。
本研究旨在通过多层次框架系统地揭示蚯蚓对土壤抗性组的长期影响：（1）描述根际和土壤主体中ARGs的分布模式；（2）揭示其活跃载体和表型表达；（3）分析潜在机制，如微生物相互作用和生态策略；（4）全面评估生态风险并构建预测模型。这项工作为了解蚯蚓在现实农业环境中对土壤抗性组的长期影响提供了新的见解。
实验设计
2018年起，在中国江苏省盐城市滨海县进行了为期两年的玉米-小麦轮作实验；采用随机区组设计，每种处理有三个重复。在2018年玉米生长季节开始时，设置了有一次性的蚯蚓处理（以每平方米60个个体的实际田间密度添加Metaphire guillelmi）或无蚯蚓对照（品种Yufeng 303）。评估了这一初始操作的遗留效应
蚯蚓调节长期土壤抗性组和病毒动态
宏基因组学和病毒组学分析显示，在长期实验田中存在多种ARGs、VFGs和MGEs，根际土壤中的丰度高于土壤主体，特别是在第二年（文本S4；图S1–S4；图2A–B），证据表明在没有蚯蚓的情况下ARGs丰度增加了18.5%（P < 0.01），而在蚯蚓存在的情况下增加了15.3%（P < 0.05）（图S3），这表明根际可能是抗性传播的热点区域
结论
我们的研究系统地提供了基于实地的证据，表明蚯蚓在现实的作物轮作系统中是土壤抗性组的长期调节者。虽然根际仍然是ARG富集的关键风险区域，但蚯蚓作为关键的生态过滤器，通过同时抑制与病毒相关的ARGs和高风险ARGs，改变微生物的生活史策略，并稳定跨界生态网络，从而起到决定性过滤作用
环境影响
在现实的田间作物轮作系统中，蚯蚓对土壤抗性组的长期调节作用仍不甚清楚。微生物组装过程、生活史策略、病毒-宿主相互作用和跨界网络关联共同塑造了抗性组的动态和环境风险。本研究表明，蚯蚓作为长期的生物过滤器，抑制了病毒相关和高风险的ARGs，改变了微生物的生活史策略，从R-策略转变为K-策略，并稳定了
CRediT作者贡献声明
朱东：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、资源管理、项目实施、方法论、资金获取、概念构思。李洪哲：软件、方法论、数据管理。杜帅：软件、方法论、正式分析。刘博文：方法论、调查、数据管理。吴迪：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、资源管理、资金获取、概念构思。丁颖：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（42222701、42090063和42307033）、中国科学院战略性先导科技专项（XDB0750400）以及宁波市永江人才计划（2022A-163-G）的财政支持。
