《Advanced Biology》：PRC2-Related Epigenetic Age Acceleration in Acute Myeloid Leukemia with DNMT3A and IDH2 Mutations
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本研究利用因果性富集的表观遗传时钟（如AdaptAge和DamAge），揭示了急性髓系白血病（AML）中DNA甲基化（DNAm）动态变化与PRC2（多梳抑制复合物2）靶点之间的密切联系。研究发现，在携带DNMT3A和IDH2突变的细胞遗传学正常AML（CN-AML）中，适应性表观遗传年龄加速（AdaptAge）与改善的总生存期（OS）显著相关，并证实PRC2靶点的甲基化水平（PRC2m）是连接特定基因突变与表观遗传衰老的关键桥梁。这项工作为理解AML发病机制提供了新的表观遗传视角，并展示了AdaptAge作为潜在生物标志物在遗传分层AML治疗中的价值。
引言：衰老、表观遗传与急性髓系白血病
衰老是一个多因素过程，其特征包括表观遗传重塑。其中，DNA甲基化（DNAm）已成为估计表观遗传年龄（EA）和量化衰老的稳健生物标志物。表观遗传时钟（epi-clock）是一种数学模型，可将多个CpG位点的加权DNAm水平汇总为表观遗传年龄。当EA偏离实际年龄向上加速时，即为表观遗传年龄加速（EAA），这可能使个体易患多种衰老相关疾病，包括急性髓系白血病（AML）。AML是一种严重的血液系统恶性肿瘤，其特点是髓系细胞分化受阻。与许多其他癌症不同，新发AML的基因突变相对较少，且约45%的患者表现为细胞遗传学正常（CN-AML），这为研究不受广泛细胞遗传学改变混淆的异常DNAm提供了独特模型。在AML中最常发生突变的基因包括那些参与DNAm的基因，如DNMT3A、IDH1/IDH2和TET2。这些突变通常会破坏表观遗传景观和细胞功能，促进AML的发病机制。近年来，新的因果性富集的表观遗传时钟（如AdaptAge和DamAge）已被开发出来，它们能区分衰老过程中的两种对立生物学力量：AdaptAge捕捉与适应性机制相关的CpG位点的甲基化变化，这些变化可能赋予对年龄相关衰退的抵抗力或中性影响；而DamAge则反映与驱动功能恶化的退行性过程相关的CpG位点的甲基化改变。CausAge则是结合了适应性和损伤性CpG位点的表观遗传时钟。
结果1：AML中因果性富集表观遗传时钟预测的独特EA
为了检验DNAm改变在AML患者中的意义，研究分析了来自TCGA-LAML数据集的194名患者的EA，并与对照组（633名年龄在19至101岁之间的个体）进行了比较，分别使用了广泛应用的Horvath泛组织时钟（353个CpG位点）和最新的因果性富集时钟。评估显示，与对照组相比，AML患者使用泛组织时钟和CausAge均表现出显著的EAA，平均EAA分别为20.0年和29.5年，表明AML队列中的DNAm改变类似于在老年个体中观察到的趋势。为了解耦AML患者中的有害和适应性DNAm变化，研究使用了AdaptAge和DamAge来分析这些改变。与对照组相比，AML患者的AdaptAge值显著升高，平均EAA为106.8年。相反，AML患者的DamAge与对照组相比没有表现出显著的升高或降低。这一发现表明，大量的适应性甲基化转变可能表明具有高AdaptAge值的AML患者对衰老相关衰退具有韧性。
结果2：AdaptAge和DamAge能够敏感地捕捉短期医疗干预
为了评估AdaptAge和DamAge作为短期临床干预中的动态生物标志物的潜力，研究分析了一个接受地西他滨（DAC，一种广泛用于表观遗传治疗的DNA低甲基化剂HMA）治疗的不同AML队列。在标准化5天地西他滨方案治疗的患者中，在三个时间点（基线第0天、第8天和第15天）收集外周血样本并分离AML原始细胞进行纵向DNA甲基化分析。AdaptAge和DamAge均表现出对治疗期间时间性DNAm变化的敏感性。与基线（第0天）相比，AdaptAge在第8天显著下降，并在第15天部分反弹，但仍显著低于基线水平。相反，DamAge表现出相反的趋势，在第8天短暂增加，然后在第15天下降至基线以下。相比之下，Horvath泛组织表观遗传时钟未能在第8天或第15天检测到显著变化。这些结果表明，依赖静态甲基化相关性的传统表观遗传时钟可能对短期治疗扰动缺乏敏感性。为了评估这些动态变化是谱系特异性的还是全局低甲基化的假象，研究分析了来自AML原始细胞和T细胞（淋巴谱系）的配对样本。值得注意的是，AdaptAge和DamAge的变化仅限于髓系原始细胞，在T细胞中未观察到显著变异。这种谱系特异性强调了AdaptAge和DamAge在髓系恶性肿瘤中的潜在效用，并排除了DAC诱导的跨血细胞类型全局低甲基化的混淆效应。
结果3：适应性甲基化与携带DNMT3A和IDH2突变的CN-AML患者总生存期评估相关
为了探索AML患者遗传突变与AdaptAge和DamAge值之间的关联，研究筛选了CN-AML患者中所有可统计分析的致病性变异（携带者数量>2）进行分层差异分析。观察到携带DNMT3A、IDH2和CEBPA突变的AML患者与非携带者相比，表现出不同的EA水平。其他在多个AML队列中反复发现的主要突变基因，如FLT3、NPM1和TP53，在使用泛组织时钟或CausAge预测进行评估时，未显示出显著的EA或EAA。由于DNMT3A和IDH2编码对DNAm至关重要的蛋白质，且其突变携带者数量相对较大，便于统计分析（分别为47和18），因此随后的分析集中在携带这些基因突变的患者上。分析揭示，与非携带者相比，携带DNMT3A突变的AML患者表现出显著较低的AdaptAge和较高的DamAge，均表明不利的DNAm变化。这种不利的表观遗传特征与其降低的总生存期（OS）相符。DNMT3A突变在AML中主要集中在R882热点，导致错义突变并促进白血病发生。进一步分析显示，与携带非R882 DNMT3A突变的患者相比，携带DNMT3A R882突变的患者表现出更显著的AdaptAge降低和DamAge增加，表明R882变异加剧了衰老相关的表观遗传失调。相反，与非携带者相比，携带IDH2突变的患者表现出显著较高的AdaptAge和较低的DamAge值，表明更有利的DNAm变化。携带IDH2突变患者的OS在诊断后治疗的前18个月高于无IDH2突变的患者，表明在早期治疗阶段存在短暂的生存优势。接下来，研究将携带DNMT3A或IDH2突变的新发CN-AML患者根据中位数分为高AdaptAge组和低AdaptAge组。生存分析显示，高AdaptAge患者与低AdaptAge患者相比，表现出显著改善的OS。尽管类似分层后DamAge未能区分生存结果，但低DamAge患者相对于高DamAge患者显示出OS改善的趋势。这些发现表明，在DNMT3A和IDH2突变的AML中，升高的AdaptAge值与有利的临床轨迹相关。
结果4：细胞遗传学驱动的表观遗传复杂性显著影响AML中的EA预测
AML中存在染色体畸变。细胞遗传学异常的分析对于AML是不可或缺的，它代表了AML患者最重要的预后因素。为了研究反复出现的细胞遗传学畸变是否与衰老相关的DNAm变化相关，研究根据欧洲白血病网（ELN）建议中的细胞遗传学和分子标准，将AML队列分为十个细胞遗传学亚组。使用四个表观遗传时钟（AdaptAge、DamAge、CausAge、泛组织时钟）比较这些亚组间的EA。未观察到EA的显著差异，这表明存在两种可能的解释：亚组内存在表观遗传异质性，使得在当前样本量下难以显示任何统计学差异；或者基于DNAm的表观遗传时钟可能缺乏分辨率来捕捉根源于结构性染色体改变的表观遗传失调。为了进一步评估EA的临床相关性，研究将队列分为标准预后风险组（良好、中等、差）。随后的分析再次显示风险类别、核型正常性或患者性别之间没有显著的AdaptAge或DamAge差异。这些结果表明，当前基于DNAm的时钟预测的EA与AML的遗传风险分层不一致。在具有异常细胞遗传学的AML中应用表观遗传时钟可能需要额外的分层。
结果5：改变的PRC2m与AML中的适应性表观遗传衰老相一致
鉴于DNAm通过调节转录因子（TF）的DNA结合在基因调控中起关键作用，研究旨在鉴定在表现出DNAm相关扰动的调控区域中富集的TF。为此，研究对来自ENCODE的332个TF在DNMT3A或IDH2突变的AML患者的差异甲基化CpG（DMC）处进行了富集分析，分别分析每个突变亚组。引人注目的是，只有两个TF——EZH2和SUZ12，它们是PRC2的核心亚基——在DNMT3A突变的AML中的DMC处显示出显著富集。在IDH2突变队列中的平行分析同样确定了EZH2和SUZ12是富集程度最高的TF之一。这些发现提示PRC2参与AML发病机制中的EA预测。为了验证这些发现，研究计算了四个表观遗传时钟（AdaptAge、DamAge、CausAge和Horvath的泛组织时钟）预测的EA与全基因组ENCODE来源的TF结合位点DNAm值之间的Pearson相关系数。值得注意的是，在控制实际年龄后，EZH2和SUZ12在与AdaptAge相关的部分相关系数中表现出最高值。其他高度相关的TF包括组蛋白修饰剂（KDM4A、ASH2L、RBBP5、PHF2、HDAC6）、PRC1亚基（RNF2、CBX2）和基因组完整性调节因子ZEB1。EZH2和SUZ12也列在与泛组织时钟和CausAge时钟相关性最高的候选因子中。然而，所有相关系数均未超过0.50。与AdaptAge更强的关联突出了其在AML中与PRC2介导的甲基化动力学的独特联系。PRC2结合位点的甲基化变化与基因表达的改变相关，后者可影响细胞衰老过程。如果在AML患者中一致观察到与年龄相关的PRC2m模式，这些变化可能与患者的实际年龄相关。然而，研究未发现PRC2m与实际年龄之间的相关性，表明AML中的PRC2m改变是由致白血病过程驱动，而非正常衰老。为了进一步研究PRC2m的作用，研究比较了携带DNMT3A或IDH2突变的AML患者的PRC2m水平。携带DNMT3A突变的患者表现出显著降低的PRC2m，而携带IDH2突变的患者则表现出升高的PRC2m，这呼应了DNAm相关基因突变在衰老相关表观遗传失调中的作用。虽然在AML患者中未检测到PRC2m与实际年龄之间的显著相关性，但在控制实际年龄的影响后，PRC2m与DamAge呈负相关，与泛组织时钟、CausAge和AdaptAge的EA值呈正相关。观察到的最强关联是与AdaptAge，这意味着PRC2在AML发病机制的表观遗传衰老适应性反应中起重要作用。为了排除AML相关的PRC2靶点全局高甲基化的混淆，研究比较了PRC2靶点中的CpG位点与四个表观遗传时钟中的CpG位点。只有0.2%的CpG位点在PRC2靶点与AdaptAge或DamAge时钟之间重叠。此外，这些表观遗传时钟的异常值显示最小的重叠。这些结果表明，AdaptAge可以通过PRC2通路捕捉特定的适应性效应，而非非特异性的甲基化变化。
结果6：AML中PRC2靶点处获得适应性表观遗传衰老
先前的研究表明，在胚胎干细胞中由PRC2结合的低甲基化区域，在人类外周血单核细胞中表现出与年龄相关的DNAm增加。为了研究这种现象在AML中是否保守，研究通过排序PRC2结合的低甲基化区域并计算其在AML样本中的平均甲基化水平来分析DNAm模式。引人注目的是，与非AML对照组相比，使用实际年龄或泛组织表观遗传时钟时，AML队列未显示PRC2靶点处预期的渐进性DNAm增加。因此，在衰老研究中观察到的PRC2靶点处随年龄一致增加的DNAm在AML队列中并不明显。有趣的是，某些较年轻的AML患者亚组在这些区域显示出比较年长亚组更高的甲基化增益——这一趋势与健康人群和先前研究中的观察不一致。为了解决这一差异，研究用AdaptAge替代了实际年龄。在AML和对照组队列中，PRC2靶点处出现了一个清晰且一致的与年龄相关的甲基化增加。此外，AdaptAge提高了表观遗传衰老分层的分辨率，使得能够清晰区分AML队列内的年龄亚组。这种增强的敏感性甚至延伸到AML中先前缺乏可辨别的年龄相关甲基化模式的弱PRC2结合位点。这些发现表明，在评估AML中的EAA方面，AdaptAge优于泛组织表观遗传时钟。
讨论与结论
衰老是一个非线性和异质性的过程，其特征是生理功能进行性恶化。表观遗传学的先前进展使得能够通过特定CpG位点的DNAm模式来量化生物年龄。著名的模型包括Horvath的泛组织时钟、Hannum的基于血液的时钟、PhenoAge和各种表观遗传时钟，这些时钟将甲基化状态与多种疾病（包括遗传病、神经病理学和某些癌症）中的年龄相关结果相关联。然而，这些工具主要基于关联性，并在健康人群上训练，这限制了它们在疾病背景下的适用性。随着因果性富集的表观遗传时钟（如AdaptAge和DamAge）的发展，出现了一种范式转变，这些时钟能区分衰老过程中的适应性和有害甲基化变化。这项研究提供了一个潜在的框架来检验表观遗传失调如何与疾病表型相关。AML，特别是CN-AML，为研究表观遗传时钟提供了一个独特的模型，因为其相对较低的突变负荷和表观遗传相关基因突变的高发生率。CN-AML约占新发AML病例的50%，其特征是缺乏染色体异常，但经常发生DNMT3A和IDH1/IDH2等基因的突变。此类突变的主导地位使AML成为一个信息丰富的环境，用于评估因果性富集的时钟是否捕获疾病相关的甲基化动力学。由于CH相关突变对造血干细胞行为产生多样且有时相反的影响，表观遗传衰老的精确测量可能最终有助于解释不同的治疗反应。由于实际年龄只是生理衰老的一个近似值，研究检验了AdaptAge在遗传分层的AML亚组中的相关性。在携带DNMT3A和IDH2突变的CN-AML患者亚组中出现了较高的AdaptAge值，表明OS改善。有趣的是，DNMT3A突变通常导致AML中的全局低甲基化，而IDH突变导致AML中的高甲基化表型。这些观察表明，AdaptAge可能捕获突变连接的表观遗传重塑超越全局甲基化变化的方面。除了预后，研究评估了时钟对治疗干预的敏感性。对接受DAC治疗的AML患者外周血原始细胞的纵向分析显示，AdaptAge和DamAge动态跟踪了治疗诱导的表观遗传重塑，而传统的时钟和匹配的T细胞对照显示很少或没有反应。这些模式表明，因果性富集的时钟可能对疾病特异性的DNAm重塑敏感。机制上，AdaptAge的预后能力可能与其与PRC2m的关联有关。PRC的错误定位已在许多血液恶性肿瘤中有报道，包括AML。在DNMT3A突变AML中，降低的PRC2m水平（可能是全局低甲基化的继发结果）破坏了PRC2在CpG岛（CGI）的定位，损害了基因沉默和造血分化。相反，IDH2突变AML表现出升高的PRC2m，并赋予侵袭性较低的表型。这些不同的PRC2m谱与临床结果一致。尽管这些模式与亚组特异性的AdaptAge生存关联平行，但研究的发现仍然是相关性的，并未建立机制联系。这项研究通过对经过临床注释的队列进行突变相关DNAm模式的高分辨率分析，系统性地探索了AML中的表观遗传衰老。一个关键优势在于其包含了具有统计效力的复发性突变患者亚组，使得能够在EAA和分子亚型之间建立稳健的关联。然而，有几个局限性需要考虑。首先，TCGA-LAML队列仅为亚组分析提供了中等效力，并且缺乏全面的治疗特异性注释。其次，尽管此处使用的时钟被设计为组织不可知的，但它们在具有异常细胞群（如AML原始细胞）的恶性肿瘤中的性能值得进一步研究，理想情况下使用单细胞DNAm分析。第三，从HumanMethylation 450K BeadChip获得的DNAm数据存在方法学限制，限制了DNAm分析的全面性。第四，在研究和AML细胞系中都观察到了在不同表观遗传时钟中存在实际年龄极不一致的异常个体。这些异常值突出表明，EA是生物过程（包括克隆选择和治疗诱导的压力）的复合指数，而不是实际年龄的直接替代物。具有纵向样本的更大队列对于描绘特定突变类型和功能影响如何调节EA轨迹至关重要。将扩展的DNAm覆盖与PRC2-AgeIndex、染色质可及性和其他多组学数据整合，可能有助于阐明AML中衰老相关甲基化模式的生物学意义。总之，研究结果提供了探索性证据，表明因果性富集的表观遗传时钟为AML特异的DNAm重塑提供了额外的见解，特别是在与遗传分层整合时。虽然AdaptAge显示出亚组特异性的生存关联并且似乎对治疗相关变化有反应，但机制细节仍未解决。这些结果突出了未来研究AML中疾病相关衰老特征作用的潜在方向，有待在更大队列中验证。
