《Conservation Science and Practice》：Environmental factors affect the condition of critically endangered freshwater pearl mussels by disrupting terrestrial–aquatic resource connectivity
1 引言
淡水蚌类（Unionida）在水生生态系统中扮演重要角色，但全球范围内其种群正因人类活动而迅速衰退。其中，淡水珍珠蚌（FPM, Margaritifera margaritifera）作为极度长寿但极危的物种，其数量在欧洲已下降超过90%。FPM是河川生态系统的关键种，其种群衰退可能对生态系统功能产生深远影响。除了直接的栖息地退化，人类活动对集水区陆地生态系统的改变如何间接影响FPM的健康状况尚不清楚。FPM被视为集水区尺度保护的“伞护种”，但其与陆地资源连通性（特别是食物资源变化）的关系此前未受关注。生态系统的连通性支撑着生物多样性、生产力和食物网动态。淡水生态系统通过集水区和河岸带与陆地生态系统相连，接收资源补给，但也因此易受集水区土地利用变化的扰动。农业和林业实践会增加北方河流的污染和营养负荷。了解流动系统与周围陆地生境的连通性如何支持或使水生生物暴露于外部威胁，对其有效管理和保护至关重要。资源通量（如不同生境间的有机物转移）相较生物移动研究较少。陆地有机物可构成溪流有机物输入的主体，尤其在遮荫和贫营养的河岸生态系统中，其原位初级生产受限。作为穴居滤食者，淡水蚌类（包括FPM）通过吸收同化陆地有机物（直接以颗粒有机物形式或间接通过微生物循环），成为连接陆地有机物输入与水生食物网的关键环节。然而，这种与陆地资源通量的关联也可能增加它们暴露于间接人为影响的风险。
本研究旨在通过覆盖芬兰29个FPM种群的区域尺度实地研究，探究陆地生态系统改变是否通过干扰有机物输入和破坏生态系统连通性间接影响FPM。研究结合水质、集水区特征和年均水温的原位测量，以及多个个体和种群水平的FPM状况指标，并利用氢稳定同位素分析量化FPM组织中同化的陆地有机物比例，作为资源连通性的代理指标。具体目标为：(1) 测量FPM组织中陆地来源有机物的比例，并将其作为FPM与周围陆地生态系统相对资源连通性的代理指标；(2) 调查环境因素和陆地生态系统改变是否影响资源连通性的程度；(3) 探究FPM的多个健康状况方面如何同时受到通过陆地有机物贡献的连通性程度以及环境的影响。
2 材料与方法
2.1 研究区域与野外采样
在2019年至2021年夏季（6月-9月），对芬兰北部四个地理区域的29个河流FPM种群进行了采样。在每个河流中，随机采样最多30个FPM个体（共842个），并测量其壳开口阻力（SOR）。从测量的30个个体中，27个放归原采集地，保留3个最大的个体（共84个）用于生长率测量和进一步实验室分析。样本量受FPM的濒危状态限制，活体FPM采集均获得相关地区经济、交通和环境中心的特别许可。采集的FPM个体用于SALMUS项目内的多种目的和分析。
FPM密度（个体数/m2）根据2011年至2021年间收集的种群调查数据估算。调查方法采用浮潜或水肺潜水进行的随机样带调查。密度估算使用最接近河流采样点的调查样带中的活蚌计数。
潜在的陆地和水生有机物来源从每个研究点的三个不同地点收集：河流内和上游湖泊（表征水生生产来源），以及汇入河流的沟渠（或当沟渠不可用时的小支流）（表征最终进入河流的陆地输入）。河流内来源在蚌床上游采集。湖泊采样点位于蚌床上游的湖泊出口处。尽可能在蚌床上游进行沟渠采集。收集了各种可用的潜在来源，包括水生苔藓（河流和湖泊）、丝状藻类（河流和湖泊，作为水生生产的代理）、溶解性有机物（DOM，河流、湖泊、沟渠）、颗粒有机物（POM，河流、湖泊、沟渠）、土壤（河边）、脱落的针叶和树叶（河边）。由于采样方法的复杂性，无法收集大量纯浮游植物（理想的水生端元），因此使用丝状藻类作为水生生产的δ2H代理指标。对于DOM和POM样品，收集20升水并进行两次过滤。
从河流采样点收集水质样品，用于分析叶绿素a（Chl-a）、总悬浮固体（TSS）、溶解性有机碳（DOC）、总氮（TN）和总磷（TP）的浓度。还测量了电导率和pH值。使用预校准的传感器现场直接测量溶解氧浓度（%）。安装HOBO温度记录仪测量河流水温至少一年。此外，从每条河流收集水样用于测定水的δ2H值。
2.2 样品处理与分析
所有FPM个体（即30个中的3个）存活运至实验室，测量长度和重量后，在采样后1-10天内解剖。提取足部组织用于稳定同位素分析，并储存在-20°C。解剖后，测量个体FPM壳上年轮，计算采样前5年的平均标准化生长指数（SGI），以校正个体发育的影响。
冷冻的食物来源和FPM足部组织样品冷冻干燥至恒重。然后检查食物来源样品，清除大型无脊椎动物、土壤残留物和其他外源物质。将冷冻干燥的样品用研钵和杵研磨成细粉。必要时，对坚硬的蚌足组织进行液氮处理以方便研磨。
水质分析遵循芬兰标准协会的协议。Chl-a浓度（μg/L）使用热乙醇提取法通过分光光度法测量。TSS通过GF/C过滤分析。DOC和TN浓度（mg/L）使用总有机碳分析仪从经过0.45 μm CA注射器过滤器的20 mL样品中进行分析。TP通过分光光度法分析。
2.3 稳定同位素分析
对于FPM足部组织的C:N比，称取500–700 μg冻干材料放入锡囊密封。对于所有氢稳定同位素测量，称取350 μg材料放入银杯，在密封前于实验室大气中暴露至少3天，以使样品和实验室空气之间的可交换氢达到平衡。
组织氢稳定同位素值和C:N比在于韦斯屈莱大学稳定同位素实验室测量。使用元素分析仪测量C:N重量比。δ2H值使用同位素比值质谱仪联用元素分析仪测定。δ2H稳定同位素比值相对于国际标准VSMOW报告，并以δ（‰）表示。从河流收集的水样使用激光光腔衰荡光谱分析仪分析δ2H值。
对于δ2H测量，每轮分析中均分析两种参考材料的多个重复样。每轮重复参考材料δ值的标准偏差始终小于3.6‰。FPM足部组织样品的脂质含量（%）根据C:N比估算。乙醇保存个体的δ2H值和C:N比根据既定方法进行校正。使用公式对足部组织样品的δ2H值进行膳食水贡献校正，其中ω设定为0.22。
2.4 集水区数据
所有与河流和集水区特征相关的空间数据均使用桌面地理信息系统QGIS和数据集成平台FME计算。集水区使用河流采样点作为排放点进行划定。集水区土地利用特征源自CORINE土地覆盖2018栅格数据。土地利用类型分为城市区域、农业区域、泥炭地森林、矿质土森林、总森林面积、湿地和水体。保护区域数据源自芬兰环境研究所提供的自然保护区和荒野保护区数据集。
使用芬兰森林中心（FFC）收集的森林使用通知来计算集水区林业管理行动和历史的空间显式估计。数据限制在2000年之后以反映近期的森林管理历史。计算了整体林业强度指数（所有森林经营作业）和更新采伐强度指数（预期皆伐）相对于总林业面积的比例。此外，私有林面积比例来自FFC的私有林数据库。沟渠从地形数据库（<2 m水道）中提取，并缓冲25 m以计算沟渠面积的估计值。所有面积均报告为相对于集水区大小的百分比。
六个采样点位于芬兰-俄罗斯边境附近，其集水区延伸至俄罗斯联邦境内。对这些集水区的航拍图进行了视觉检查，定性表明国家边界两侧的土地利用和林业实践相似。因此，对于这些河流，假设这些集水区内芬兰领土的数据代表整个集水区。
2.5 统计分析与建模
初步分析（Spearman等级相关）显示许多环境变量之间存在强相关性。因此，使用主成分分析（PCA）来降低所研究环境变量的维度并解释变量间的多重共线性。所有水质变量、土地利用类型、林业相关参数和其他空间信息均经过z-score标准化后纳入PCA。
潜在食物来源稳定同位素值的视觉比较表明，使用DOM（河流、湖泊、沟渠）和丝状藻类（河流、湖泊）作为代表陆地和水生来源的两个端元是合适的。DOM值倾向于落在土壤、针叶和树叶的值之间，定性地反映了陆地来源。
通过贝叶斯混合模型估计陆生和水生食物来源对FPM的同化贡献。总共拟合了三个单示踪剂、双源混合模型。模型使用无信息先验和乘法误差结构。模型包含了河流嵌套在区域内的分层空间结构。通过Gelman-Rubin和Geweke诊断验证模型收敛性。第一个模型不包含连续变量（零模型）。第二和第三个模型分别将第一和第二主成分（PC1和PC2）作为连续变量进行拟合，以确定FPM组织中陆生贡献的变化是否由环境因素驱动。使用留一法交叉验证通过比较包含与不包含PC1和PC2的模型来检验环境因素纳入模型的相对支持度。使用最佳模型估计的陆生来源在FPM饮食中比例贡献的后验概率分布来计算中位饮食及其95%可信区间。
使用线性回归模型研究环境变量（PC1和PC2）对状况代理指标的影响。考虑了蚌类生理的多个方面作为FPM状况代理指标：闭壳肌力量（SOR，个体和河流种群均值）、相对生长（SGI，个体和河流种群均值）、能量储存（脂质含量%；体长-体重关系）和种群局部状况（FPM密度）。此外，从混合模型输出中提取陆生来源对FPM组织比例贡献的后验估计值，并用于logit回归模型以评估同化生产与蚌类状况之间的关系。为每个后验估计值的抽取拟合逻辑回归模型，提供最大似然回归系数的后验分布。从提取的模型斜率分布中，为每个解释变量计算中位斜率和95% CI。如果CI包含零，则解释为饮食比例与该解释变量之间没有关系。所有统计分析和模型均使用R统计软件进行。
3 结果
3.1 FPM及潜在食物源的稳定同位素比值
对于分析的29个FPM河流种群，蚌足组织δ2H平均值范围从-149.94‰ ±2.97 到 -112.80‰。C:N比范围从3.49±0.04 到 3.82±0.02。陆生来源（DOM）的δ2H值范围从-141.65‰ ±2.01 到 -89.58‰ ±6.19，水生来源（丝状藻类）的δ2H值从-255.69‰ ±12.10 到 -156.34‰ ±4.99。环境水δ2H值范围从-103.66‰ 到 -83.67‰。
3.2 环境梯度
PCA对环境数据解释的方差比例PC1为27.65%，PC2为13.49%。具有最高载荷的变量表明PC1是一个“生产力-纬度-人为影响”梯度，因为它与Chl-a、泥炭地森林%、农业区域%、年均水温、DOC、林业强度指数和沟渠面积%呈正相关，而与矿质土森林%、公有林业面积%、纬度、集水区总森林面积%、保护区域%呈负相关。因此，PC1载荷较高的河流通常是生产力更高、更偏南、更温暖、集水区内农业、沟渠和林业活动增加的河流。相反，PC1载荷更负的河流是更偏北、寡营养、更寒冷、集水区内农业、沟渠和林业行动较少但森林和保护区域较多的河流。
PC2更微妙，与电导率、更新采伐指数（皆伐）和林业强度指数正相关，但与集水区大小（包括和不包括延伸至俄罗斯的区域）、采样点上方湖泊距离和沟渠面积%负相关。
3.3 陆生来源对FPM组织的贡献
混合模型比较表明，包含PC1的模型得到更强支持。陆生食物源整体构成了FPM同化物质的大部分，全局中位数为75.6%（95% CI 58.1%–85.9%）。然而，不同种群间的比例贡献存在差异，后验中位估计范围从60.3%（CI 42.6%–71.6%）到90.2%（CI 74.6%–98.7%）。
陆生来源的比例随着PC1得分的增加而降低，表明在生产力更高、更偏南、受人为影响更大的河流中，FPM对陆地有机物的利用程度较低。PC1模型的乘法误差项中位数较低，为0.10（CI 0.06–0.19）。随机效应“区域”和“河流”的标准差后验密度中位数分别为0.27（CI 0.01–1.56）和0.36（CI 0.18–0.69），表明在与陆地生态系统的连通性上存在明显的河流间和区域间变异，并且这两个因素在解释成年FPM饮食变异方面似乎同等重要。
3.4 FPM的物理状况
结果表明，本研究中的FPM就其闭壳肌力量而言处于良好状态。29个种群中有17个种群的平均SOR值等于或大于4.5（满分5），未观察到最低等级（垂死-严重应激）。然而，以平均SGI衡量的相对生长，在过去5年平均年增长从-1.25到0.86（总体平均-0.31，SD ±0.63）。脂质含量和体长-体重关系范围分别为7.14%至13.16%和1.15至3.62 g/mm，显示个体蚌类的能量储存可变。FPM密度差异很大，从0.02到58.8 个体/m2。
观察到PC1与种群水平（即均值）SOR和个体SOR之间存在负线性相关。未观察到PC1与其他状况变量之间的显著相关性，也未观察到PC2与任何状况变量之间的显著相关性。
逻辑回归模型斜率的后验分布表明，FPM同化的陆地有机物比例与SGI（个体和种群均值）之间存在正相关关系，表明在资源连通性更高的条件下，FPM在过去5年的相对生长更高。
与陆地连通性相反，唯一与环境梯度直接相关的状况指标是SOR（个体和种群水平），SOR随着PC1值的增加而降低。
4 讨论
4.1 FPM作为跨环境梯度的陆地-水生资源连通性指标
我们估计了FPM同化的陆地有机物比例，作为FPM与周围陆地生态系统相对资源连通性的代理指标，发现所有成年FPM种群都大量依赖陆地生产（约60%–90%）。这证实了FPM在我们研究区对陆地有机物的依赖性，并突出了采样河流与周围陆地生态系统之间强连通性的广泛程度。然而，我们进一步发现，FPM同化的陆地有机物比例沿着环境梯度向南部、生产力更高和受人为影响更大的河流减少。淡水生态系统中有机物输入的可用性和组成取决于区域气候和局部集水区特征。因此，环境变化可以改变陆地-水生资源连通性，以及进入淡水生态系统的有机物的数量和质量。由于淡水蚌类的同化饮食取决于有机物的相对可用性，我们的观察结果可能由（a）沿环境梯度陆地输入减少，（b）沿环境梯度原位生产力增加，或（c）两者共同驱动。
在我们研究的芬兰北部地区，森林以及因此产生的林业主导着景观。林业活动在景观层面动员了陆地有机物，这些有机物随后直接进入水生生态系统，沟渠进一步加速了这一过程。这与我们的环境数据相符，河流DOC与林业强度指数共变，而非林业面积。因此，我们预期沿环境梯度（PC1增加）由于林业的直接影响，陆地输入会增加，但这与我们的结果相反。相反，很可能是林业促进原位生产力的间接效应超过了陆地有机物输入的直接增加。林业活动除了陆地有机物外，还释放营养物质，可以刺激原位藻类生产。这在诸如本研究涉及的寡营养水域中尤其重要，低营养浓度限制了藻类生长。我们的数据表明，采样溪流中的叶绿素水平也与林业强度共变，意味着整个研究区域河流不仅“褐化”（陆地输入增加）也可能“绿化”（水生生产增加）。同时，其他几个环境因素可能协同促进原位藻类生产和生长，包括水温升高和农业（通过营养径流），从而导致尽管陆地输入增加，但FPM同化的水生来源生产相对更多。
4.2 FPM状况随着陆地连通性降低和人为压力增加而下降
在测量的五个FPM状况指标中，只有SGI（个体和种群水平）与相对陆地连通性共变，随着FPM中同化的陆地资源贡献增加而增加。这表明在更高的连通性下，FPM相对于其整个生命周期平均增长的近期增长（测量生命最后5年）更高。然而，更高的SGI不一定反映绝对状况良好，如果FPM在其生命周期的大部分时间里经历了恶劣条件。这里分析SGI的FPM年龄从54到254岁不等，因此对某些个体而言，二战后密集的林业时期可能构成了它们生命的大部分。历史SGI数据表明，低个体增长期与该地区林业密集期一致。急性实验室实验也表明，随着林业活动增加的水体浊度会导致短期生理应激和行为反应（减少觅食），这可能降低FPM生长。这可以解释为什么SGI与我们的FPM连通性代理指标共变，而不是与我们的PC1环境梯度直接相关，因为同化的陆地资源可能更好地跟踪林业引起的原位胁迫。由于SGI不提供绝对生长的度量，这也可以解释为什么SGI不直接与PC1相关，而PC1包含已知会增加FPM绝对生长速率温度梯度。
与环境梯度直接相关的唯一状况指标是SOR（个体和种群水平），SOR随着PC1值的增加而降低。SOR量化了双壳类的闭壳肌力量，被认为反映了FPM在几个月内的摄食条件。因此，SOR与环境相关而非与FPM同化的陆地资源相关是值得注意的，因为后者应能更好地反映长期饮食。然而，根据我们的结果，SOR可能反而反映了与变化环境条件相关的FPM生理应激，因为我们的PC1梯度包含了水温升高和水质下降。类似的量化闭壳肌力量的指标已被证明与扇贝在热应激下的存活率以及FPM的生理应激相关。这一点值得注意，因为集水区的保护和管理行动可能同时反映在SGI和SOR状况代理指标中，但更小空间和时间尺度的变化可能在SGI中无法检测到，使得SOR更适用于较短时间尺度监测FPM的健康状况，反之亦然。
5 对保护与管理的启示
河流和溪流是全球受威胁最严重的生态系统之一，生物多样性迅速下降，许多栖息物种在全球范围内高度脆弱。其中，淡水蚌类因其滤食活动提供重要的生态系统服务，将河流的整个水生群落与周围陆地生态系统联系起来。淡水蚌类在水生生态系统中的关键作用使其成为广泛保护工作的目标生物，旨在保护水生生态系统的功能。本研究表明，在遭受林业行动和其他土地利用活动的河流中，被破坏的陆地资源连通性降低了濒危河流蚌类物种的生理状况。虽然FPM受益于增加的相对陆地连接，但如果并发的营养添加刺激了原位生产，则增加的陆地物质通量并不会增加连通性。当前对濒危淡水蚌类的保护工作主要集中于幼蚌培育以及寻找和恢复幼蚌及宿主鱼的合适栖息地。然而，我们的研究结果强调了集水区尺度保护措施（如强度较低的土地利用和保护区的建立）在保护成年FPM栖息地完整性方面的重要性。鉴于全球河流蚌类的状况，我们的结果不仅对FPM重要，也可能为更广泛地保护和管理受威胁的蚌类物种提供信息。由于公有林业面积比例在人为压力较低的地区更大，芬兰私有林主在其森林和FPM集水区实施生态可持续管理行动的作用至关重要。这凸显了与抑制生物多样性危机和减轻土地利用影响（如林业行动）相关的政策决策的关键作用。
