《Communications Biology》：Temporal dynamics of collateral RNA cleavage by LbuCas13a in human cells
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本研究针对CRISPR-Cas13系统在真核细胞中是否保留其原核生物中特有的"collateral RNA cleavage"（旁系RNA切割）活性这一关键科学问题，系统揭示了LbuCas13a以核糖核蛋白形式递送入人细胞后，可引发快速、广泛的胞质RNA降解，并激活先天免疫通路导致细胞凋亡。该发现不仅阐明了Cas13在真核环境中的活性特征，更开创性地将其转化为一种靶向RNA表达水平的细胞负向筛选工具，为肿瘤细胞清除、基因编辑富集等精准医学应用提供了新策略。
在细菌与病毒永无休止的进化军备竞赛中，CRISPR-Cas系统扮演着关键防御角色。其中，CRISPR-Cas13因其独特性吸引了众多科学家：它不切割DNA，而是精准靶向并切割RNA。更引人注目的是，其在原核生物中一旦被特定靶RNA激活，便会展现出"不分敌我"的RNA切割能力，即"旁系切割活性"，这被认为能通过诱导细菌休眠来保护群体。然而，当科学家们将Cas13这一利器引入更为复杂的真核细胞（如人类细胞）时，情况变得扑朔迷离。早期研究欢呼其能够实现比RNA干扰技术更高效、特异的基因敲低，成为RNA研究的新宠。但近年来，一些研究团队在应用Cas13时却意外遭遇了细胞毒性问题，暗示着这种旁系切割活性可能在真核细胞中并未完全消失。这种活性究竟是否存在？其动态过程如何？又会引发细胞怎样的反应？这些问题不仅关乎对Cas13基础生物学的理解，更决定了其能否安全、有效地应用于未来的基因治疗。
为了回答这些问题，由莱顿大学医学中心的Jorik Frederik Bot、赵志晗等人组成的研究团队在《Communications Biology》上发表了他们的研究成果。研究人员首先系统比较了六种不同Cas13同源蛋白（LbuCas13a、LwaCas13a等）的体外旁系切割活性，发现LbuCas13a活性最强。当他们通过iTOP（一种利用高渗和丙胺甜菜碱诱导蛋白质胞内递送的方法）或电转方式，将LbuCas13a蛋白与引导RNA形成的核糖核蛋白复合物递送到人细胞中，并靶向高表达的外源（如dEGFP）或内源（如18S rRNA、GAPDH）转录本时，观察到了强烈的总RNA降解现象。这种降解在50分钟内启动，200分钟左右达到高峰，甚至24小时后仍有残留。这种旁系切割活性在不同细胞系（HAP1、RD、U2OS、ARPE19）中均存在，但程度有异。重要的是，当LbuCas13a通过质粒在细胞内表达时，却未观察到类似活性，提示高浓度的RNP递送是关键。
这种大规模的RNA破坏触发了细胞的强烈应激反应。RNA测序分析显示，在LbuCas13a激活16小时后，细胞转录组发生显著改变，大量与先天免疫应答相关的基因（如细胞因子、趋化因子相关基因）以及即时早期反应基因（如JUN、FOS、EGR家族）被上调，同时脂肪酸代谢相关通路被抑制。活细胞成像进一步证实，靶细胞会进入凋亡程序，最终死亡。研究人员巧妙地将这一细胞毒性转化为一种应用优势：开发了一种靶向RNA的细胞负向筛选工具。通过靶向混合细胞群中特定细胞所高表达的RNA（如EGFP转录本或癌基因CDK4），LbuCas13a能有效清除目标细胞，甚至可进行多轮筛选来富集基因编辑成功的细胞。
为了更深入地理解旁系切割的全局影响和分子细节，研究者结合了总RNA测序（使用ERCC外参RNA进行标准化）和纳米孔直接RNA测序技术。总RNA测序揭示，LbuCas13a激活导致了近乎全局性的蛋白编码mRNA损失，中位损失率在200分钟时超过50%，而线粒体编码的mRNA和某些核内非编码RNA（如MALAT1）则相对耐受。纳米孔测序不仅直观展示了转录本读长的大幅缩短，还通过分析转录本覆盖度，发现了大量特异的切割位点。这些位点往往位于预测的茎环结构区域，且倾向于在尿嘧啶残基附近进行切割，这与LbuCas13a的体外切割偏好一致。
关键技术方法
本研究主要运用了以下关键技术：1) 多种Cas13同源蛋白的重组表达与纯化；2) iTOP渗透压法和电穿孔法进行核糖核蛋白复合物的细胞内递送；3) 5‘-3’ RT-qPCR（逆转录定量聚合酶链式反应）用于定量分析靶RNA与旁系RNA的降解动态；4) 活细胞成像（使用Annexin V和CellTox Green染料）监测细胞凋亡与死亡；5) 总RNA测序结合ERCC（外部RNA控制联盟）spike-in对照RNA，以准确量化全局转录本变化；6) 牛津纳米孔长读长测序用于解析RNA切割位点与结构偏好性。研究所用细胞系包括人近单倍体细胞HAP1、横纹肌肉瘤细胞RH30/RD、骨肉瘤细胞U2OS以及视网膜色素上皮细胞ARPE19。
LbuCas13a exhibits strong collateral RNA cleavage activity in human cells
研究人员通过生物分析仪检测总RNA完整性，发现仅在表达dEGFP靶标的HAP1-dEGFP细胞中，LbuCas13a与靶向dEGFP的引导RNA共同转染后，总RNA图谱出现了特征性的降解片段，这些片段在18S核糖体RNA峰前形成数个新峰，而在野生型HAP1细胞中则无此现象。通过计算这些降解片段的曲线下面积，确定其丰度在转染后100-200分钟达到峰值。5‘-3’ RT-qPCR分析进一步证实，靶RNA（dEGFP）的降解几乎立即开始，而旁系RNA（GAPDH）的降解启动稍晚，约100分钟时达到高峰，500分钟后恢复。其他测试的Cas13同源蛋白（LwaCas13a, PspCas13b, BzCas13b）仅显示出微弱的靶RNA降解，旁系切割活性不显著。
Different RNP delivery methods support LbuCas13a collateral cleavage
研究证实旁系切割活性不依赖于特定的递送方法或靶标类型。电穿孔递送LbuCas13a RNP靶向内源的高丰度转录本（RPS19, GAPDH, 18S rRNA）同样引发了强烈的总RNA降解。然而，当通过质粒转染使细胞表达LbuCas13a蛋白时，即使能检测到蛋白表达，也未能诱导出旁系切割活性，强调了高浓度RNP递送的重要性。
Collateral cleavage occurs in all tested cell lines
在HAP1、RD、U2OS和ARPE19四种人源细胞系中，靶向18S rRNA、GAPDH或RPS19均能诱导出相似模式的RNA降解，表明旁系切割具有普适性。其中，HAP1细胞表现出最显著的降解效应，可能与iTOP在该细胞系中递送效率较高或其近单倍体特性有关。即使在常报道Cas13活性较低的HEK293T细胞中，通过电穿孔递送靶向GAPDH和18S rRNA也能观察到降解，尽管程度较轻。
RNA targeting with LbuCas13a induces cell death via apoptosis
活细胞成像实验清晰显示，只有在表达dEGFP靶标的HAP1-dEGFP细胞中，LbuCas13a激活才会导致细胞凋亡：转染后约7.5小时，早期凋亡标志物Annexin V阳性细胞数显著增加，约15小时后，死细胞染料CellTox Green阳性细胞数随之上升，此过程符合凋亡特征，而非坏死。
Application of LbuCas13a as a cell selection tool
基于上述发现，研究团队开发了LbuCas13a的细胞筛选应用。将表达EGFP的HAP1细胞与野生型细胞混合后，用靶向EGFP的LbuCas13a RNP处理，可特异性减少EGFP阳性细胞的比例。多轮筛选能进一步富集阴性细胞。筛选效率与靶RNA的表达水平呈正相关，但在极高表达时可能达到平台期。此策略成功应用于富集通过Cas12a介导的基因编辑修复了EGFP荧光的细胞，以及特异性清除因基因组扩增而高表达CDK4癌基因的横纹肌肉瘤RH30细胞。
Genes involved in the innate immune system are upregulated after collateral RNA cleavage
RNA测序分析发现，LbuCas13a激活16小时后，细胞转录组发生剧烈变化，806个基因显著上调，41个基因下调。上调基因显著富集于先天免疫应答相关通路，如细胞因子-细胞因子受体相互作用、IL-17信号通路、TNF信号通路和NF-κB信号通路，表明大规模的RNA降解触发了类似病毒RNA识别后的细胞内免疫反应。
Collateral RNA cleavage leads to near global mRNA loss
利用ERCC spike-in RNA校正的总RNA测序显示，在LbuCas13a激活50分钟和200分钟后，蛋白编码转录本出现近乎普遍的耗竭，中位log2折叠变化分别达-0.66和-1.18。高丰度转录本更易被降解。线粒体mRNA和某些核非编码RNA则相对稳定。在降解过程中，一些应激反应基因（如FOS, JUN, EGR1）被诱导上调。
Characterizing collateral RNA cleavage using nanopore sequencing
纳米孔测序直接证实了广泛性RNA切割：靶向dEGFP的样本中，长读长（>1000 nt）转录本数量急剧减少。转录本覆盖度分析揭示了靶RNA原型间隔区附近的特异性切割，以及在众多非靶mRNA和胞质非编码RNA上存在的重复出现的切割位点。这些位点常位于预测的茎环结构的单链环区，且偏好切割尿嘧啶残基，与LbuCas13a的体外特性一致。
结论与讨论
本研究详细描绘了LbuCas13a在人细胞中诱导靶向和旁系RNA切割的时间动态图谱。其旁系切割活性导致胞质RNA近乎全局性耗竭，进而触发强烈的先天免疫应答和细胞凋亡。研究表明，Cas13旁系活性的显现取决于多个因素：同源蛋白的固有活性、细胞内RNP浓度、靶RNA表达水平以及细胞系特异性差异。该研究不仅深化了对Cas13在真核环境中行为的理解，更重要的是，它将这种"副作用"转化为一种强大的应用工具，实现了基于特定RNA表达水平的靶向细胞清除，为基因治疗、癌症治疗（特别是针对过表达癌基因的肿瘤）和细胞工程中的负向筛选提供了新的精准手段。未来，通过蛋白质工程优化Cas13活性、探索更优的递送策略以及结合细胞周期同步化等方法，有望进一步提升其筛选效率和特异性。
