《FEBS Open Bio》：Nuclear pore links Fob1-dependent rDNA damage relocation to lifespan control
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本研究揭示了在芽殖酵母中，核孔复合物通过介导受损核糖体DNA（rDNA）从核仁内部向核仁-核质界面（邻近核膜）的空间重定位，从而稳定Fob1蛋白引发的rDNA损伤、维持基因组稳定性并调控复制寿命。这项工作阐明了核孔在空间组织DNA损伤应答中的关键作用，将此前相互独立的观察（核仁退出与核孔关联）统一为一个机制框架，深化了对亚核结构如何影响基因组稳定性和衰老的理解。
受损rDNA定位于核仁-核质界面的核膜附近
核糖体DNA（rDNA）是核仁的主要结构组成部分。为了更详细地分析受损rDNA的亚核定位，特别是其与核膜和核仁的关系，研究团队通过荧光显微镜将细胞核划分为六个区域进行观察。为了在rDNA内诱导损伤，研究人员使用了携带半乳糖诱导型归巢内切酶I-SceI表达的菌株，该酶可在rDNA重复序列中产生特异的DNA双链断裂（DSB）。通过将TetI与mRFP融合，并结合整合在I-SceI识别位点附近的tetO阵列，可以对DSB位点进行可视化。核区室则通过核仁标记蛋白Nop1-CFP和主要染色核质的DAPI进行识别。在DSB诱导前，mRFP焦点主要位于核仁中心或邻近核膜的核仁-核质边界。在S/G2期细胞中，核仁中心区域的定位尤为富集。在DSB诱导120-240分钟后，受损rDNA主要积累在邻近核膜的核仁-核质边界区域。在G1期，该区域的定位在断裂后0至240分钟内持续增加。而在S/G2期，其定位在120分钟时从25%增加至51%，但在240分钟时下降至37%，这可能反映了短暂的重新定位以及随后通过复制相关的途径（如断裂诱导复制，BIR）进行的修复，该过程会将受损或正在修复的rDNA从核周边置换出去。
这种定位促进了与DNA修复因子（特别是Rad52）的接触。Rad52是一种关键的、仅存在于核质中的同源重组（HR）蛋白。在DSB诱导后，对rDNA与Rad52空间关系的考察发现，两者的共定位在诱导120分钟后最常发生在核仁-核质边界区域，表明Rad52主要在核质中与DSBs结合。与rDNA损伤的空间特异性相比，在MAT基因座诱导的损伤则主要停留在核质的周边区域，显示出不同的定位模式。这些发现表明，受损的rDNA从核仁内部移动到核仁、核质和核膜交汇的连接处。这个位置代表了实现两个先前观察到的事件——核仁退出和与核膜结合——所需的最小移动量。
Fob1诱导的损伤是nup120Δ细胞中rDNA不稳定的主要原因**
为了研究与核仁-核质边界重叠的核周定位的生理作用，研究使用了nup120缺失突变体，该突变体会损害rDNA与核孔的锚定。已知NUP120的破坏会引发rDNA不稳定。由于rDNA不稳定性通常由Fob1的活性触发，研究探讨了核孔是否有助于修复此类损伤。Fob1结合在复制叉屏障（RFB）上，单向阻滞复制叉前进，导致DSB形成和rDNA不稳定。为了验证nup120Δ细胞中观察到的rDNA不稳定性是否依赖于Fob1，研究进行了脉冲场凝胶电泳（PFGE）来分析染色体XII。结果显示，nup120Δ细胞表现出强烈的rDNA不稳定性。相比之下，nup120Δ fob1Δ双突变体显示出清晰可辨的Chr. XII条带，其信号强度与nup120Δ单突变体相比部分恢复，但未达到野生型或fob1Δ单突变体的水平。这表明nup120Δ细胞中的大部分rDNA不稳定性源于Fob1诱导的DNA损伤。
核孔关联通过Fob1依赖性和非依赖性途径影响复制寿命
rDNA不稳定性是酵母复制寿命（RLS）的主要决定因素。稳定的rDNA维持促进长寿，而不稳定性则会缩短寿命。为了评估NUP120缺失对寿命的影响，研究在标准条件下进行了RLS分析。野生型细胞的平均寿命约为23代，而nup120Δ细胞的寿命显著缩短至约6代。在nup120Δ背景中删除FOB1可显著将寿命恢复至11代，达到野生型约一半的水平。尽管PFGE表明nup120Δ fob1Δ双突变体中的rDNA稳定性相对于nup120Δ单突变体部分恢复，但其寿命仍然适度缩短，这表明Nup120可能通过除rDNA维持之外的其他途径影响寿命。鉴于nup120Δ细胞中的rDNA不稳定性在很大程度上依赖于Fob1，研究人员提出核孔关联有助于恢复Fob1诱导的rDNA不稳定性，这与核孔在保护复制相关DNA损伤方面的已知功能一致。
讨论
受损rDNA重新定位到与核膜接触的核仁-核质界面，这一发现指向一种可能促进精确修复的空间机制。这种定位将受损的rDNA基因座与核仁内完整的重复序列分离开来，从而最大限度地减少异位重组的机会，同时允许其接触仅存在于核质中的Rad52。与同样与核质接壤的区域VI相比，在区域III的优先积累可能反映了从核仁分离和核膜锚定两者的共存。这种结构类似于在高等真核生物中观察到的核仁帽，其中核膜向内凹陷形成一个支持同源重组的核周帽结构。本研究结果支持了nup120Δ细胞中观察到的rDNA不稳定性主要是Fob1依赖性的观点，表明核孔为解决与复制叉停滞相关的rDNA损伤提供了一个平台。最后，研究证明了核孔稳定rDNA的功能影响复制寿命。NUP120的缺失 drastically 缩短了寿命，但移除FOB1部分挽回了这一缺陷。寿命未能完全恢复至野生型水平，表明核孔不仅有助于rDNA的维持，也有助于其他基因组位点的稳定。这些发现共同支持了一个模型，即核孔关联有助于恢复Fob1诱导的rDNA不稳定性，并且此外，还通过影响基因组稳定性和复制寿命的Fob1非依赖性途径发挥作用。
