《Microchemical Journal》：Salt-assisted efficient blood plasma separation on a microfluidic paper-based analytical device with integrated on-chip colorimetric sensing of albumin
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盐功能化微流控纸器件通过渗透压效应实现高效血浆分离，纯度达99.998%，检测白蛋白的色反应准确度与临床方法高度一致（R2=0.99），适用于无稀释单滴血样本的便携式诊断。
斯姆里蒂·辛哈（Smriti Sinha）| 西琳·达斯古普塔（Shirin Dasgupta）| 苏门·达斯（Soumen Das）
印度理工学院卡尔加普尔分校医学科学与技术学院，721302，印度
摘要
利用盐改性的微流控纸质设备进行血浆分离已成为一种简单且具有吸引力的方法。然而，血浆产量低以及缺乏系统的质量评估仍然是限制其实际诊断应用的关键瓶颈。在这项研究中，我们提出了一种高效的血浆分离策略，该策略利用了高渗氯化钠（NaCl）的渗透效应与纸质基底特性的协同作用。在孔径小于红细胞的纸上，盐诱导红细胞（RBC）聚集，从而实现被动且均匀的血浆分离。使用5级滤纸时取得了最佳性能，在临床相关的血细胞比容范围（7–58%）内，血浆分离效率达到了52–74%，且无需稀释血液。对分离出的血浆进行了全面的质量评估，确认其纯度超过99.998%，残留细胞含量极少，溶血程度轻微（约0.09 g/dL）。此外，通过基于溴甲酚绿的比色法检测白蛋白蛋白，展示了该平台的诊断潜力。该检测方法与标准临床方法表现出强烈的相关性（r = -0.99，R2 = 0.99），临床准确率为95.45% ± 2%，重复性为RSD ≤ 9%，Bland-Altman一致性偏差为0.06 g/dL。此外，该平台在60天内保持稳定性能，检测限与金标准方法相当，为0.70 g/dL。这些结果突显了集成μPAD平台从单滴血液中快速、准确地进行白蛋白检测的潜力，因此适用于经济实惠且可靠的诊断环境。
引言
早期和准确的疾病诊断是有效医疗保健的基石。然而，传统集中式诊断系统依赖于复杂的基础设施、专业人员和广泛的物流支持，在资源有限的环境中难以实施。因此，将诊断服务从集中式实验室转移到患者附近成为确保服务及时性和公平性的关键策略。即时诊断（POC）技术通过使用少量样本和资源，在患者护理现场或附近实现快速、可靠、用户友好的疾病检测，满足了这一需求。[1]、[2]。
血液在体内循环，促进了众多生物标志物在组织和器官之间的传输。因此，血液通常是感染、炎症、代谢紊乱等相关变化最早显现的地方，甚至在这些症状出现之前。血液成分，特别是血清和血浆，含有反映人体健康状况的蛋白质、激素、代谢物等指标，使其成为疾病诊断的宝贵生物基质[3]。然而，血浆中存在红细胞（RBC）会干扰分析性能，降低测试准确性[4]。因此，为了确保诊断结果的准确性和可靠性，通常需要从全血中去除细胞成分以获得无细胞的血浆或血清。此外，随着对样本到结果POC诊断平台需求的增长，需要能够在单一平台上集成样本制备、血浆分离和生物标志物检测的设备[5]。传统的血浆分离技术（如离心[6]和沉淀[7]）虽然有效，但需要离线处理，这限制了它们与POC检测的兼容性。为了解决这一限制，最近的一些进展集中在开发无需电力、人力驱动且便携的离心平台上，例如fidget-spinner离心机[8]、手动力离心机[9]、hand-fuges[10]和Atmosfuge[11]。这些设备展示了在资源匮乏和电力有限的环境中简化微尺度血浆分离和单步血浆转移的可行性。然而，它们的操作性能，特别是旋转速度，以及相应的血浆产量，高度依赖于用户操作，可能导致用户间差异较大和分析结果不一致。替代方法，如微流控技术，利用血液流变学和微尺度流体动力学实现了芯片上的血浆分离和生物标志物检测[12]、[13]。尽管这些系统在分析上具有鲁棒性，但它们通常依赖于外部驱动力，并涉及复杂的制造和操作程序，增加了成本，限制了其在常规诊断中的实用性，尤其是在分散式环境和未经培训的人员使用中。同时，也探索了基于压力[14]和毛细作用[15]、[16]、[17]的过滤方法，但这些方法由于细胞、蛋白质和其他血液成分的积累导致的膜污染问题，常常导致血浆产量不稳定和分析可靠性降低。
为了解决这些挑战，基于微流控技术的纸质分析设备（μPADs）因其高孔隙率、被动毛细驱动流动、成本效益、生物相容性和易于制造而成为有前景的平台[18]、[19]。μPAD上的血浆分离主要通过两种策略实现：（i）毛细驱动扩散和（ii）μPAD的化学或生化改性。在毛细驱动方法中，分离依赖于血细胞和血浆通过纸纤维的扩散速率差异，使血浆和细胞成分在空间上分离[20]、[21]。然而，这种方法通常需要缓冲溶液来促进扩散，这会导致生物标志物浓度稀释，从而影响血浆纯度和分析性能。在改性方法中，纸质基底经过处理，使红细胞聚集或凝集，减缓其在纸基质中的移动，同时允许血浆向前渗透。例如，用于血型检测的试剂，特别是抗A、抗B和抗D抗体[22]、[23]，通过抗原-抗体相互作用选择性地固定红细胞，从而允许血浆通过纤维素纤维孔隙[24]、[25]、[26]。尽管有效，但这种方法需要预先知道血型，并依赖于可能在变化环境中失去稳定性的抗体，最终限制了设备的可靠性。基于壳聚糖的改性也被用于聚集红细胞；然而，其密集的聚合物网络限制了血液流动，需要大量缓冲液稀释才能获得可接受的血浆产量，再次降低了生物标志物浓度[27]、[28]。
最近，Nilghaz等人[29]展示了在盐改性的μPAD上进行血浆分离，沉积的盐创建了高渗微环境，诱导红细胞变形和固定，使血浆通过毛细作用前进和分离。虽然这种方法在简单性和货架稳定性方面具有明显优势，但由于血浆分离效率较低（<30%），尚未有效转化为市场-ready解决方案。为了提高效率，建议对整个μPAD进行层压，以减缓血浆渗透过程中的蒸发，使血浆能够行进更远的距离，分离效率可达70%。然而，这种策略仍然需要至少1:1的血液稀释才能可靠运行[30]，从根本上限制了其用于真正的全血分析的适用性。同时，盐改性的μPAD已被集成到芯片平台上，用于从全血中进行血浆分离和生物分析物检测，无论是否添加缓冲液[31]、[32]、[33]。然而，这些研究更侧重于概念验证，而非分离性能的严格优化和验证。因此，直接从未稀释的全血中实现高效血浆分离的持续挑战仍未得到充分解决。此外，对血浆质量参数（特别是残留细胞含量（纯度%）和溶血程度的全面评估也大多被忽视。这种遗漏代表了分析化学中的一个关键缺口，因为残留的血液细胞会干扰后续的生化检测，导致结果不准确或误导。同样，溶血过程中红细胞的破裂会将血红蛋白（Hb）释放到血浆中，自由Hb会显著扭曲诊断测量结果，特别是在比色法中[34]、[35]。因此，确保高血浆纯度和最小溶血程度对于建立分离血浆的分析有效性和临床相关性至关重要。
血浆分离后，必须将其用于后续的生物传感应用。将血浆分离与芯片上的目标生物分析物检测相结合，提供了一种简单且用户友好的方法，用于快速和现场疾病诊断。在血浆中存在的大量生物标志物中，白蛋白是一种重要的血浆蛋白，因为它在维持胶体渗透压以及肝脏、肾脏和营养障碍的诊断中起着重要作用[36]、[37]。最近，已有几种方法报道了在μPAD上进行血浆分离和比色法检测白蛋白；然而，由于多种因素的限制，这些方法在分散式环境中的广泛应用仍然有限。例如，使用稀释血浆[21]、[30]的系统通常灵敏度较低，因为稀释会改变分析物浓度、基质复杂性和血浆的物理化学性质。此外，使用商业膜过滤器[38]、[39]分离的血浆经常遇到重复性问题，血浆产量不一致是一个主要限制。这些开发平台中的另一个缺点是使用人工样本进行校准，而不是真实血浆，这忽略了影响传感器准确性的内在生物基质变异性。总体而言，这些限制突显了一个未解决的分析化学挑战：缺乏一个既能高效分离未稀释全血中的血浆，又能提供适合定量生物传感分析的验证血浆的集成μPAD平台。特别是，尚未建立血浆分离性能、血浆质量指标和下游检测可靠性之间的系统联系。
在这项工作中，我们通过全面分析盐改性μPAD上的血浆分离来解决这些关键问题。我们系统地研究了影响血浆分离效率的关键物理化学参数，并显著提高了从未稀释的全血中分离血浆的效率。该方法的使用可行性进一步通过指尖采血得到了验证，证实了其适用于实际POC诊断。通过量化残留细胞含量和评估溶血程度，严格评估了血浆纯度，从而确保了分离血浆的分析可靠性。此外，我们通过将基于溴甲酚绿（BCG）的比色法集成到分离后的血浆中，展示了该平台的实际效用。因此，这项研究不仅加深了对盐改性纸上血浆分离的基本理解，还提出了一个具有验证纯度和可靠生物传感能力的强大平台，解决了先前方法在临床和商业应用方面的关键限制。
部分摘录
化学品和试剂
Whatman 1级、2级、4级和5级滤纸购自Cytiva（美国密苏里州圣路易斯）。盐酸多巴胺和冻干Hb粉末购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。99.9%的氯化钠（NaCl）、尿素（99%）、肌酐（99%）、d-葡萄糖、尿酸（99%）、牛血清白蛋白（98%（BSA）和BCG指示剂购自Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd.（印度孟买）。乙醇购自Chanshu Hongheng Fine Chemical有限公司（99.9%（CSS）。
基于盐的红细胞聚集机制及在NaCl改性μPAD上的血浆分离
在裸露的纸质基底上，全血通过毛细作用以单相形式渗透通过纤维素微纤维基质，形成各向同性的扩散和均匀的血斑，见图1(a)。光学显微镜图像（图1(b)）显示了血斑边缘的放大视图，突出了裸露纸上没有血浆分离的情况。图1(c)显示了在盐改性纸（4% w/v NaCl）上的血滴。盐改性纸上的血液渗透受到...
结论
我们开发并验证了一种简单、可重复且成本效益高的μPAD，用于利用高渗NaCl改性从未稀释的全血中高效分离血浆。研究表明，纸质基底的物理化学性质和关键实验参数（包括盐浓度、血液体积和血液HCT水平）显著影响血浆分离效率。孔径最小的纸质基底实现了均匀且高效的分离...
致谢
我们感谢印度人力资源发展部提供的财政支持。我们非常感谢B.C. Roy医疗医院病理科的高级技术员Kanchan Pattanayak先生提供的含有实际血细胞比容和血清白蛋白浓度的血液样本。
作者贡献声明
斯姆里蒂·辛哈（Smriti Sinha）：写作 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、可视化、验证、方法论、数据分析、概念化。西琳·达斯古普塔（Shirin Dasgupta）：写作 – 审稿与编辑、方法论、数据管理。苏门·达斯（Soumen Das）：写作 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、调查、概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
