《Journal of Phycology》：Species delimitation within the Achnanthidium minutissimum complex (Bacillariophyta), based on morphological, molecular, and ecophysiological approaches
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本文采用整合分类学方法，结合形态学（LM/SEM）、分子系统学（rbcL基因与基因组浅层测序）和生态生理学（温度/盐度生长实验）数据，对来自欧洲的13株微小曲壳藻（Achnanthidium minutissimum）复合群菌株进行物种界定研究。结果表明分子与生态生理数据总体支持基于形态的物种划分，但发现A. jackii与A. cf. microcephalum在分子和生态生理特征上无法区分，提示可能需要归并。研究凸显了整合多维度数据在厘清疑难硅藻类群物种边界、提升生物指示应用精度方面的重要价值。
引言
微小曲壳藻（Achnanthidium minutissimum）是一种广泛分布于淡水底栖环境的单壳缝硅藻，隶属于一个分类学上极具挑战性的物种复合群。该类群个体微小、形态特征重叠度高，仅凭光学显微镜（LM）难以准确区分，导致物种鉴定存在较大不确定性，进而影响其作为生物指示物种在水质评估中的应用。传统的物种描述多依赖于形态学特征，分子数据匮乏，而结合实验生态生理学数据支持物种界定的研究更为罕见。本研究首次对来自德国、瑞典和斯匹次卑尔根的13株单克隆菌株，综合应用形态学（LM和扫描电镜SEM）、分子生物学（rbcL基因标记和基因组浅层测序）以及生态生理学（不同温度和盐度条件下的生长反应）数据进行整合分析，旨在检验不同数据集之间的一致性，并应用基于多物种溯祖模型的多基因座物种界定方法，系统性探讨微小曲壳藻复合群内的物种边界。
材料与方法
研究菌株与培养条件
本研究共使用了13株单种培养的硅藻菌株，其中4株分离自德国，3株来自斯匹次卑尔根，其余6株源自瑞典，部分菌株保藏于比利时协调微生物保藏中心/根特硅藻库（BCCM/DCG）。所有菌株在PK520 WLED气候箱中于15°C、14:10小时光暗周期、100 ± 6 μmol photons · m?2· s?1光强下，使用添加硅酸盐的合成淡水培养基（SFM + Si medium）进行培养，并在实验开始前进行为期2周的驯化。
形态学评估样品制备
为进行LM和SEM观察，样品采用次氯酸盐漂白法清洗。LM观察使用尼康Eclipse Ni显微镜和100倍油镜，SEM观察使用Apreo S LoVac扫描电镜。物种鉴定参考了Jüttner、Lange-Bertalot、Novais、Pinseel、Ponader & Potapova、Tseplik和Van de Vijver等人的文献。
DNA提取与rbcL基因扩增
使用NucleoSpin Soil Mini Kit提取基因组DNA。以DPrbcL1和DPrbcL7为引物扩增约1550 bp的rbcL基因片段。PCR产物纯化后，通过Sanger法测序，并使用Geneious Prime软件进行序列组装比对。系统发育树采用邻接法（Neighbor-Joining）和最大似然法（Maximum Likelihood, ML）构建。
鸟枪法基因组测序与组装
对所有菌株进行Illumina鸟枪法测序（约10 million 150 bp双端读长）。针对Boye_8菌株，额外采用牛津纳米孔技术（ONT）进行长读长测序以获得更连续参考基因组。使用NextDenovo进行组装，并通过SqueezeMeta流程过滤掉可能来源于细菌的contig，保留被归类为硅藻门（Bacillariophyta）的contig。使用BUSCO（Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs）评估基因组完整性并鉴定单拷贝直系同源基因。基于BUSCO基因集，分别采用Astral-Pro3进行物种树推断（基于基因树摘要方法）和IQ-TREE2对串联序列进行ML系统发育分析。同时应用SODA进行基于多基因座溯祖理论的物种界定。
生态生理学实验设计
通过设置4个温度梯度（15、20、25、30°C）和10个盐度梯度（0（对照）至2000 mg Cl?· L?1），评估各菌株的生长速率（以体内叶绿素荧光值为指标）。实验在24孔板中进行，每个处理设置5个重复。生长速率通过对数生长期内荧光值的对数进行线性回归计算。
结果
菌株形态学评估
基于LM和SEM观察，菌株被鉴定为以下几个类群：
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A. minutissimum（瑞典菌株Bjurbaecken_1032, _1093, _1097, Fiskonbaecken_1038）：瓣线形椭圆至线形披针形，尖端略延长呈喙状至亚头状。壳缝面中轴区窄，中央区多变；壳缝对面中央区几乎缺失。 striae由2-5个圆形孔纹组成，通常在非尖端区域有1个裂缝状孔纹。
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A. cf. microcephalum（德国菌株Boye_1, Boye_6）：形态与A. minutissimum相似，但壳缝面striae上的孔纹数似乎更多。
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A. jackii（德国菌株Boye_8, Kinzig_30）：瓣线形披针形，尖端宽圆形。壳缝面中央区形成清晰的 fascia。striae密度通常较低。
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A. cf. angustum（斯匹次卑尔根菌株Spitsbergen_403, _414, _0822 和瑞典菌株Fiskonbaecken_1094）：壳缝对面中轴区较A. minutissimum更呈披针形。
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A. cf. lineare（斯匹次卑尔根菌株Spitsbergen_428）：瓣线形至窄披针形，尖端宽圆形，不延长。与A. lineare不同，其中央区不形成 fascia。
rbcL基因系统发育分析
基于rbcL基因序列的系统发育分析将13个菌株划分为4个主要谱系（Lineage A-D）：
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谱系A：包含形态上鉴定为A. cf. microcephalum (Boye_1, Boye_6) 和 A. jackii (Boye_8, Kinzig_30) 的德国菌株，序列差异仅1-2 bp。
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谱系B：包含鉴定为A. cf. angustum的菌株（Spitsbergen_403, _414, _0822, Fiskonbaecken_1094），序列100%相同。
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谱系C：仅包含鉴定为A. cf. lineare的菌株Spitsbergen_428，与其他谱系差异显著（9-29 bp）。
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谱系D：包含鉴定为A. minutissimum的4个瑞典菌株（Bjurbaecken_1032, _1093, _1097, Fiskonbaecken_1038），序列差异0-1 bp。
基因组水平变异分析
基于对Boye_8菌株ONT参考基因组进行重测序比对获得的SNP子集构建的NeighborNet网络，以及基于BUSCO直系同源基因集构建的Astral和ML系统发育树，均与rbcL基因树在主要谱系划分上高度一致，支持上述四个谱系的划分。然而，基于多基因座溯祖的物种界定方法SODA将谱系D（A. minutissimum）进一步划分为三个潜在的物种。
与公共序列的比较
将本研究rbcL序列与NCBI数据库中的序列进行比较：
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谱系B（A. cf. angustum）与Pinseel等人描述的 morphodeme 2 以及Tseplik等人描述的 A. angustum 序列高度相似（差异0-3 bp）。
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谱系D（A. minutissimum）与Tseplik等人描述的 A. obscurum 以及Pinseel等人鉴定为 A. minutissimum 的序列聚在一起（差异0-3 bp）。
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谱系A（包含A. jackii 和 A. cf. microcephalum）与数据库中某个鉴定为 A. minutissimum 的序列差异很小（0-2 bp）。
生态生理学实验结果
各菌株对温度和盐度的生长响应与其分子谱系具有高度一致性：
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谱系D (A. minutissimum)：对盐度变化耐受性最强，在15、20、25°C下生长速率受盐度影响小，但在30°C下无法存活。
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谱系A (A. jackii / A. cf. microcephalum)：对盐度和温度变化敏感。在15和20°C下生长受盐度抑制明显，在25和30°C下无法生长或生长极差。
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谱系B (A. cf. angustum)：最大生长速率出现在20°C低盐条件下，盐度升高抑制生长。对30°C耐受性差。
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谱系C (A. cf. lineare)：最大生长速率较低，但在较高盐度（可达1600 mg Cl?· L?1，15°C）下仍能维持生长，对30°C不耐受。
讨论
本研究结果表明，在微小曲壳藻复合群中，分子（rbcL基因及基因组水平）和生态生理学数据的变异模式与基于瓣膜形态（SEM）的物种界定大体一致，支持将A. minutissimum、A. cf. lineare 和 A. cf. angustum 区分为不同的物种。
主要的例外出现在谱系A，形态上鉴定为A. jackii 和 A. cf. microcephalum 的菌株，在rbcL基因序列上无法区分，且具有极其相似的生态生理反应规范，提示它们可能为同一个物种（后者A. microcephalum 在命名上具有优先权）。此外，SODA方法将谱系D（A. minutissimum）进一步划分，提示该群内可能还存在更精细的物种分化，但需更多菌株验证。与Tseplik等人将A. obscurum 从A. minutissimum 中分离的观点不同，本研究的分子和生态生理数据不支持这一划分。
生态生理学实验结果揭示了不同类群特有的生态位偏好，例如A. minutissimum（谱系D）表现出广盐性，而其他类群对盐度更敏感。这种生态分化信息对于改进该类群在生物监测中的应用至关重要。
本研究凸显了整合分类学方法在解决疑难微生物类群物种界定问题上的优势。形态学 alone 往往不足。基因组浅层测序为硅藻等基因组较小的类群获取多基因座数据提供了有效途径。未来将该方法扩展到更多菌株，将有助于更清晰地揭示微小曲壳藻复合群内物种的形态、分子和生态分化格局。
结论
本研究通过整合形态、分子和生态生理数据，基本验证了基于形态学提出的微小曲壳藻复合群内部分物种边界，特别是支持将A. minutissimum、A. cf. lineare 和 A. cf. angustum 区分为不同物种。然而，数据表明A. jackii 和 A. cf. microcephalum 可能为同物异名。研究未支持将A. obscurum 从A. minutissimum 中分离。整合方法提升了对可用于物种区分的形态特征和生态特征的理解。在微小曲壳藻复合群乃至其他疑难硅藻类群中更广泛地应用此类整合方法，将有助于就物种数量与界限、可用于区分它们的形态与分子特征及其生态位分化得出可靠结论。
