利用内源性II-A型CRISPR-Cas系统对益生菌鼠李糖乳杆菌GG进行功能性工程化改造

《Microbial Biotechnology》：Exploiting the Endogenous Type II-A CRISPR-Cas System for Functional Engineering of Probiotic Lacticaseibacillus rhamnosus GG

本研究成功开发并验证了基于鼠李糖乳杆菌GG（Lacticaseibacillus rhamnosus GG, LGG）内源性II-A型CRISPR-Cas系统的基因组编辑平台。该平台通过精确鉴定PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列为5′-NGAAA-3′，并构建合成sgRNA（single-guide RNA）表达盒与同源定向修复（Homology-Directed Repair, HDR）模板，实现了LGG中靶向基因删除（如fucI, acs1）和插入（如cat, gusA），编辑效率达11.1%-25.0%。研究进一步构建了表达β-葡萄糖醛酸酶（GusA）的LGG工程菌株，证实其可用于复杂微生物群落中的菌株追踪，为LGG作为下一代益生菌（next-generation probiotics）在食品生物技术和微生物疗法中的应用提供了强大工具。

　　

利用内源性II-A型CRISPR-Cas系统对益生菌鼠李糖乳杆菌GG进行功能性工程化改造

引言

鼠李糖乳杆菌GG（Lacticaseibacillus rhamnosus GG, LGG）是研究最广泛的益生菌株之一，因其对胃酸和胆盐的强耐受性、良好的肠道上皮粘附性以及公认的安全性（GRAS status），被广泛应用于食品和临床领域。然而，缺乏高效、精确的基因组编辑工具严重限制了对其益生机制的研究和功能菌株的开发。尽管异源CRISPR-Cas9系统已成功应用于部分乳酸菌，但其存在质粒稳定性差、转化效率低、细胞毒性等问题。近年来，利用宿主内源性的CRISPR-Cas系统进行基因组编辑显示出更好的兼容性和更低的细胞毒性。LGG基因组中含有一个完整的II-A型CRISPR-Cas基因座，包括cas1, cas2, csn2和cas9基因以及一个包含24个间隔子的CRISPR阵列。本研究旨在利用LGG的这套内源性系统，建立一个精确、高效的基因组编辑平台。

PAM序列特异性验证

研究首先通过质粒干扰实验结合单核苷酸替换，确认了LGG内源性II-A型CRISPR-Cas系统所识别的PAM序列为5′-NGAAA-3′。实验表明，该PAM序列具有严格的核苷酸偏好性，其中第2位点的鸟嘌呤（G）和第4位点的腺嘌呤（A）对于有效的Cas9切割至关重要。

编辑质粒的构建与优化

研究人员构建了基于复制型质粒pTRK870的编辑系统。初期尝试使用天然的crRNA（CRISPR RNA）表达盒，但由于滚环复制质粒的不稳定性，间隔子区域易在质粒复制过程中丢失，导致高频率的野生型菌株存活。为解决此问题，研究转向使用人工设计的单链向导RNA（sgRNA），将crRNA和tracrRNA（trans-activating CRISPR RNA）通过一个AAUC环连接起来，并在乳酸杆菌NCFM来源的强组成型启动子P_pgm控制下表达。针对16S rRNA基因的sgRNA质粒转化LGG后，可转化子数量显著减少，证明了该人工sgRNA能被内源性Cas9蛋白有效识别并介导染色体切割。

实现靶向基因删除

为验证编辑系统的有效性，研究首先靶向删除L-岩藻糖异构酶编码基因fucI（LGG_02685）。构建了同时表达靶向fucI的sgRNA和携带1 kb同源臂修复模板的编辑质粒pfucI-sgRNA-RT。转化LGG后，在回收的转化子中，通过PCR筛选和测序验证，成功获得了一株ΔfucI突变株（MJM568），编辑效率为25%（1/4）。表型分析证实，MJM568无法以岩藻糖作为唯一碳源生长。此外，研究还成功删除了一个更大的1.5 kb基因组区域（CoA合成酶基因acs1），编辑效率为23.1%（3/13），证明了该系统处理不同长度缺失的能力。

实现靶向基因插入

为进一步测试系统的基因插入能力，并克服原始质粒骨架的局限性，研究构建了更小、更稳定的新编辑骨架pMJM100。利用此骨架，成功将氯霉素抗性基因（cat）表达盒插入到fucI基因位点，替换掉其640 bp片段，编辑效率为16.7%（1/6），获得菌株MJM655。该菌株表现出氯霉素抗性，而野生型LGG则敏感。

构建GUS阳性LGG菌株及应用示范

作为功能应用示范，研究将来源于格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）ADH的β-葡萄糖醛酸酶基因（gusA）表达盒整合到LGG基因组中fucose和rhamnose操纵子之间的 intergenic 区域，编辑效率为11.1%（1/9），获得菌株MJM670。该菌株在含有X-Gluc的培养基上形成蓝色菌落，而野生型为白色，证实了gusA的成功表达。与质粒携带的gusA相比，染色体整合的gusA表达在连续传代中表现出极高的稳定性。生长曲线显示，gusA的插入未影响相邻糖利用操纵子的功能。

体内追踪GUS阳性LGG

通过小鼠灌胃实验评估工程菌株MJM670在胃肠道内的存活和定殖情况。灌胃后12小时，粪便中可检测到约10⁷CFU/g的活菌，24小时后降至约10⁵CFU/g，48小时后基本清除。qPCR检测的总LGG（活菌+死菌）动态与活菌计数结果相似，表明工程菌株与野生型LGG在体内的存活动力学无显著差异，均表现为短暂定殖。基于GUS活性的平板计数法能特异性检测活菌，为研究工程益生菌在复杂微生物环境中的行为提供了有力工具。

讨论与总结

本研究成功建立了基于LGG内源性II-A型CRISPR-Cas系统的基因组编辑平台。该系统编辑效率（11.1%-25.0%）虽非最高，但足以满足常规菌株构建需求，且编辑质粒易于消除，最终菌株无疤痕、无抗性标记，符合食品和 therapeutic 应用要求。所构建的GUS阳性LGG菌株为益生菌在复杂微生物群落和宿主体内的追踪研究提供了可靠模型。该平台清除了LGG基因工程化的障碍，扩展了益生菌CRISPR工具包，为开发用于食品生物技术、精密发酵和活体生物治疗剂的下一代功能性益生菌奠定了基础。