《Molecular Psychiatry》：Single-cell characterization of the adult male hippocampus suggests a prominent, and cell-type specific, role for Nrgn and Sgk1 in response to a social stressor
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本研究针对应激相关精神疾病分子机制不清的问题，通过单细胞RNA测序技术对成年雄性小鼠后海马体进行系统性表征，发现神经颗粒素（Nrgn）和血清/糖皮质激素调节激酶1（Sgk1）是应激响应关键调控因子。研究人员构建了谷氨酸能与GABA能神经元特异性GR/MR基因敲除模型，揭示应激转录响应具有细胞类型特异性，为理解中枢应激应答网络提供了新视角。该研究创建了公开可访问的单细胞数据库，将加速应激神经生物学领域研究。
在全球范围内，应激相关精神疾病影响着超过5亿人的生活质量，包括重度抑郁症、创伤后应激障碍和焦虑症等。尽管科学家们长期致力于解析应激反应的分子机制，但由于其复杂性，中枢应激反应的具体调控网络仍不清晰。尤其令人困惑的是，为什么相同的应激刺激会在大脑不同细胞类型中引发差异化的响应？这一科学问题的解答对于开发精准治疗策略至关重要。
近日发表在《Molecular Psychiatry》的研究通过前沿的单细胞转录组技术，对成年雄性小鼠海马体进行了系统性解析。海马体作为应激反应的关键脑区，因其高表达盐皮质激素受体（MR）而成为研究糖皮质激素受体（GR）与MR相互作用的理想模型。研究人员设计了一个多层次实验方案，不仅描绘了海马体的细胞组成图谱，还揭示了急性社交挫败应激如何通过Nrgn和Sgk1等分子在不同细胞类型中调控应激响应。
研究团队采用了多项关键技术方法：通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析了34只小鼠后海马体的125,896个细胞；利用条件性基因敲除技术构建了谷氨酸能神经元（Nex-Cre）和GABA能神经元（Dlx5/6-Cre）中特异性缺失GR或MR的小鼠模型；采用5小时单次延长社交挫败应激范式；通过RNAscope和qPCR技术在独立验证队列中进行细胞类型特异性验证；使用SCANPY等生物信息学工具进行细胞聚类、差异表达分析和轨迹推断。
生成用于应激研究的后海马体分子目录
研究人员首先建立了海马体细胞图谱，通过对36只成年雄性小鼠后海马体进行单细胞RNA测序，最终获得125,896个高质量细胞。分析鉴定出29个细胞簇，涵盖神经元、胶质细胞和血管细胞三大类。通过已知解剖标记基因（如Prox1、Neurod6、Fibcd1和Spock1）的表达模式，成功将神经元集群定位到海马体的特定解剖区域（齿状回、CA1、CA3等）。神经元占总细胞比例的39.72%，其中齿状回谷氨酸能神经元（17.59%）、CA1谷氨酸能神经元（12.12%）和CA3谷氨酸能神经元（7.37%）为主要群体。
scRNA-seq揭示Nrgn作为WT动物应激反应神经元的标记物
在野生型小鼠中，研究人员观察到急性社交挫败应激主要影响少突胶质细胞、星形胶质细胞和内皮细胞。特别值得注意的是，在谷氨酸能神经元中，某些亚群（CA1 Glut 2、CA3 Glut 2和DG Glut 2）表现出比其他神经元更强的应激反应，差异表达基因数量显著更多。通过进一步分析，发现神经颗粒素（Nrgn）在这三个高反应性神经元亚群中一致性高表达。RNAscope验证证实Nrgn在海马体神经元中呈现异质性表达模式，部分神经元高表达Nrgn，而这些高Nrgn表达的神经元正是对应激有强烈反应的细胞亚群。
急性社交应激暴露导致成熟少突胶质细胞中Sgk1上调
研究发现少突胶质细胞在应激响应中变化最为显著，其中血清/糖皮质激素调节激酶1（Sgk1）表现出与应激效应的强关联。在基线条件下，Sgk1在所有少突胶质细胞群体中表达较低，而急性社交挫败应激导致成熟少突胶质细胞中Sgk1表达显著上调（Log2FC=2.44）。轨迹分析显示，Sgk1是应激成熟少突胶质细胞的主要基因驱动因子，在从少突胶质前体细胞（OPCs）到应激成熟少突胶质细胞的轨迹中早期上调。RNAscope验证表明，应激后成熟少突胶质细胞中Sgk1 mRNA表达增加了9.5倍。
研究还通过qPCR在独立队列中对选定差异表达基因进行了验证。在非神经元细胞中，Cdkn1a（少突胶质细胞）、Etnppl（星形胶质细胞）、Tmem252（内皮细胞）、Bank1（小胶质细胞）和Clec12a（巨噬细胞）均显示出与单细胞分析一致的变化方向。在神经元中，Elk1和Spink8等基因表现出区域特异性应激响应，进一步证实了单细胞数据的可靠性。
细胞类型特异性GR或MR敲除导致社交应激暴露后神经元中出现异质性转录组特征
研究人员分析了细胞类型特异性GR或MR敲除对应激响应的影响。结果显示，在GR或MR敲除条件下，WT中确定的六个响应集群（CA1 Glut 2、CA3 Glut 2、DG Glut 2、少突胶质细胞、星形胶质细胞1和内皮细胞）仍然表现出最强的应激反应。然而，神经元中的差异表达基因集合在敲除条件下表现出高度异质性，而非神经元集群中的响应则更为同质。特别值得注意的是，Sgk1在少突胶质细胞中的上调在所有五种条件（WT、GRNex、GRDlx、MRNex、MRDlx）中保持一致，表明其调控不依赖于特定GR或MR敲除。
GR和MR靶基因在细胞类型特异性敲除后显示急性应激响应中的表达变化
通过假设驱动分析，研究人员考察了已知GR和MR靶基因在敲除条件下的表达模式。在CA3 Glut 2神经元中，GR和MR靶基因 across the five mouse lines中表现出异质性模式，尤其是在WT中不显著但在至少一种GR或MR敲除系中显著的基因子集中。数据驱动分析进一步识别出具有cKO特异性应激响应的基因，这些基因表征了MR和GR敲除的差异化细胞类型特异性效应。作为概念验证，研究人员选择Resp18进行RNAscope验证，该基因在四种敲除条件下均显著，且在不同敲除系中应激后呈现不同方向的调控。验证结果成功证实了单细胞数据分析的预测，Resp18的表达变化仅在CA3高Nrgn表达神经元（Glut2）中显著。
该研究创建了目前最全面的小鼠海马体应激条件单细胞表征资源，揭示了Nrgn作为应激响应神经元标记物的重要作用，以及Sgk1在少突胶质细胞应激响应中的关键地位。研究发现，GR或MR在特定神经元类型中的缺失会导致差异化的转录组特征，表明应激响应具有高度细胞类型特异性。这些发现不仅深化了对中枢应激应答分子机制的理解，还为开发针对特定细胞类型的应激相关疾病治疗策略提供了新思路。研究人员公开了完整数据集和分析工具，预计将极大推动应激神经生物学领域的研究进展。
研究存在一定局限性，包括聚焦后海马体而非完全涵盖最腹侧区域、5小时应激范式可能捕获次级过程而非初级应激响应、每组仅三个生物学重复、Nex-Cre系在齿状回未能实现GR/MR删除以及仅使用雄性小鼠等。尽管如此，通过两个独立队列的RNAscope和qPCR验证显著增强了研究结果的可靠性。
