《Plant Physiology and Biochemistry》：ZmMKK4, a mitogen-activated protein kinase kinase, influences maize kernel size
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本研究针对玉米籽粒发育中MAPK信号通路功能未知的问题，通过CRISPR-Cas9技术构建zmmkk4基因敲除突变体，发现ZmMKK4缺失导致籽粒尺寸、重量显著降低，淀粉合成受阻且蛋白质积累异常。研究首次揭示ZmMKK4通过调控Opaque2（O2）和ZmD11等关键基因平衡碳氮代谢，为玉米高产优质育种提供新靶点。成果发表于《Plant Physiology and Biochemistry》。
玉米作为全球重要的粮食作物，其籽粒大小和成分直接决定产量和品质。然而，调控籽粒发育的分子机制，尤其是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路在其中的作用，尚不明确。MAPK级联反应作为真核生物中高度保守的信号转导模块，在植物生长发育和应激响应中发挥关键作用，但玉米中MAPKK家族成员的功能研究仍存在空白。为此，安徽农业大学研究团队聚焦ZmMKK4基因，系统解析其在玉米籽粒发育中的功能与机制。
研究首先通过系统进化分析确认ZmMKK4是水稻OsMKK4的直接同源物，其编码的蛋白含有典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域（S-TKc）。亚细胞定位显示ZmMKK4定位于细胞核和细胞膜，暗示其可能参与核内转录调控和膜相关信号转导。表达模式分析发现ZmMKK4在授粉后6天和22-30天的籽粒中高表达，提示该基因在籽粒早期细胞增殖和后期灌浆阶段均起作用。
为明确ZmMKK4的功能，研究团队利用CRISPR-Cas9技术构建了两个独立的敲除突变体zmmkk4-1和zmmkk4-2。表型分析表明，突变体籽粒的粒长、粒宽、粒厚及百粒重均显著降低，且从授粉后6天起即出现发育迟缓。扫描电镜观察发现突变体籽粒中淀粉颗粒直径显著减小（主要分布范围由野生型的9–12 μm降至7–10 μm）。生化检测进一步证实突变体总淀粉和支链淀粉含量下降，直链淀粉比例相对升高，同时粗蛋白和可溶性糖含量显著增加，表明ZmMKK4缺失引发了碳氮代谢平衡的重编程。
转录组分析揭示了表型变化的分子基础：zmmkk4突变体中有2445个差异表达基因，KEGG富集分析显著富集于“淀粉和蔗糖代谢”“植物激素信号转导”等通路。关键淀粉合成相关基因如O2（bZIP转录因子）、Bt2（AGPase小亚基）、Sh2（AGPase大亚基）、Wx1（颗粒结合淀粉合成酶I）及油菜素内酯合成关键酶基因ZmD11均显著下调。这些基因的表达下降直接导致淀粉合成受阻，而碳源的重新分配可能驱动了蛋白质的过度积累。
本研究首次阐明ZmMKK4通过调控O2-ZmD11模块平衡淀粉与蛋白质合成，从而协调籽粒发育。该发现不仅填补了玉米MAPK信号通路在籽粒形成中的功能空白，还为通过分子设计育种同步改良玉米产量和品质提供了理论依据和候选基因。
关键技术方法
研究以玉米自交系KN5585为背景，利用CRISPR-Cas9技术构建zmmkk4敲除突变体；通过定量PCR（qRT-PCR）分析基因表达模式；采用烟草瞬时表达系统进行亚细胞定位；对授粉后10天的籽粒进行RNA-seq转录组分析；通过扫描电镜（SEM）观察淀粉颗粒形态；使用生化试剂盒测定淀粉组分，凯氏定氮法检测蛋白质含量。
3.1. ZmMKK4代表水稻OsMKK4的玉米直系同源物
系统发育和蛋白结构分析表明，ZmMKK4与OsMKK4亲缘关系最近，且功能结构域高度保守，提示二者功能相似。
3.2. ZmMKK4表达模式
ZmMKK4在细胞核和细胞膜双重定位，在籽粒发育早期（6 DAP）和晚期（22-30 DAP）高表达，暗示其参与细胞增殖和灌浆调控。
3.3. ZmMKK4正向调控籽粒大小和重量
zmmkk4突变体籽粒尺寸和重量在各发育阶段均显著降低，证实ZmMKK4是籽粒发育的正向调节因子。
3.4. ZmMKK4缺陷损害淀粉生物合成并改变胚乳成分
突变体淀粉颗粒变小，总淀粉和支链淀粉含量降低，直链淀粉比例和蛋白质含量升高，表明ZmMKK4缺失导致碳氮代谢失衡。
3.5. ZmMKK4转录组分析
RNA-seq发现突变体中淀粉合成关键基因（如O2、ZmD11）显著下调，KEGG富集于代谢和激素信号通路，从分子层面解释表型变化。
研究结论与意义
本研究证实ZmMKK4是玉米籽粒发育的关键正调控因子，其通过影响O2-ZmD11等枢纽基因协调淀粉与蛋白质合成途径的平衡。该工作为解析MAPK信号通路在谷物籽粒形成中的作用提供了新视角，对玉米高产优质育种具有重要指导价值。
