《Plant Physiology and Biochemistry》：Synergism and antagonism: Unraveling the regulatory network of perianth coloration in
Dendrobium nobile Lindl.
编辑推荐：
本研究针对金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl.）花被呈色模式多样性的分子机制不明这一关键问题，通过比较野生型（WT）和两种同源异型突变体（SC、DB），结合色素分析、转录组学和功能验证，揭示了由DnMYB1、DnMYB2、DnAGL6-2和DnSEP3等转录因子通过协同与拮抗作用构建的多层次调控网络，该网络通过空间特异性表达和蛋白互作精确调控花被色斑与非色斑区域的差异着色，为兰花花色育种提供了新靶点和策略。
兰花以其千姿百态的花朵和绚丽多彩的颜色闻名于世，其中金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl.）作为兼具观赏和药用价值的明星物种，其花被（包括萼片和花瓣）颜色的多样性尤为引人注目。然而，这些复杂颜色模式，特别是唇瓣上独特的色斑是如何形成的，其背后的分子调控机制一直是植物学家和育种家亟待破解的谜题。传统的ABC模型及其扩展版本虽然解释了花器官身份决定的基本框架，但对于金钗石斛这类具有高度特化花器官的兰科植物，其精细的颜色调控网络仍知之甚少。尤其是一些自然发生的同源异型突变体，例如花瓣呈现唇瓣特征的SC突变体，以及侧萼片呈现唇瓣特征而背萼片呈现花瓣特征的DB突变体，为研究花器官身份转换与颜色模式形成的耦合关系提供了绝佳的材料。
为了深入解析金钗石斛花被呈色的奥秘，研究人员在《Plant Physiology and Biochemistry》上发表了最新成果。他们以野生型（WT）和两种自然突变体（SC和DB）为材料，系统开展了从表型观察到分子机制的多层次研究。
研究采用的关键技术方法包括： 对花发育不同阶段（S1, S3, S5, S8）进行色素定性与定量分析；对WT、SC、DB的不同花器官区域进行转录组测序（共84个样本），筛选差异表达基因；利用系统发育树分析鉴定关键的R2R3-MYB和MADS-box转录因子；通过异源瞬时过表达和病毒诱导基因沉默（VIGS）在蝴蝶兰和金钗石斛中进行基因功能验证；运用酵母单杂交（Y1H）和酵母双杂交（Y2H）技术分析转录因子与靶基因启动子的结合能力以及蛋白间的相互作用。
3.1. 花部形态与色素沉积比较
研究发现，WT的花被几乎全为紫色，唇瓣基部有紫红色斑块；SC的萼片为白色，花瓣呈唇瓣状且基部有紫红色斑块；DB的背萼片呈花瓣状着色，侧萼片呈唇瓣状且基部有紫红色斑块。这些表型差异为后续分子机制研究奠定了基础。
3.2. 不同发育阶段色素分析
色素分析表明，金钗石斛花被颜色演变是一个从叶绿素主导到花青素主导的色素转换过程。S1阶段花被呈绿色，主要依赖高水平的叶绿素。随着发育进行，叶绿素降解与花青素合成同时启动，呈现显著负相关。至S5阶段，花青素含量达到峰值并超过叶绿素，最终决定了S8阶段花被的紫红色表型。关键基因DnDFR和DnANS在WT S5阶段的唇瓣斑块区、SC的唇瓣和花瓣斑块区以及DB的唇瓣和侧萼片斑块区均呈现特异性高表达，提示它们是花部色斑形成的关键因子。
3.3. R2R3-MYB转录因子的筛选与表达模式分析
从转录组数据中鉴定出45个R2R3-MYB转录因子。系统发育分析显示，DnMYB1和DnMYB2与参与花青素合成的SG6亚组成员聚为一支。表达模式分析揭示，DnMYB1特异性在WT S5阶段、SC和DB的色斑区域高表达，而DnMYB2则在非色斑区域特异性高表达，暗示它们通过空间特异性分布调控色斑与非色斑区域的着色差异。
3.4. MADS-box转录因子的筛选与表达模式分析
鉴定出46个MADS-box转录因子。DnSEP3（属于SEP3/AGL9支）在非色斑区域特异性高表达，而在色斑区域低表达。DnAGL6-2（属于AGL6-2支）则呈现相反的表达模式，在色斑区域高表达，在非色斑区域低表达。这种表达模式的互补性提示它们可能以拮抗方式调控颜色模式。
3.5. DnMYB1和DnMYB2的功能验证
在蝴蝶兰中异源过表达DnMYB1导致花被出现大面积深紫红色区域，而过表达DnMYB2则出现大面积浅黄色区域伴基部紫红色脉状色素沉积，两者均显著提高花青素含量。在金钗石斛中利用VIGS技术沉默DnMYB1或DnMYB2均导致花被色素缺失和花青素含量显著降低，证实二者均正调控花青素合成，但其空间特异性表达决定了着色模式的差异。
3.6. DnAGL6-2和DnSEP3的功能验证
在蝴蝶兰中过表达DnAGL6-2引起花被出现红色块状区域伴黄色色素，而过表达DnSEP3则引起绿色区域伴少量红色色素，两者均增加花青素含量。在金钗石斛中沉默DnAGL6-2或DnSEP3均导致色素缺失和花青素含量降低，证实二者亦为正调控因子。值得注意的是，VIGS还引起了花器官的形态学变化，表明它们同时参与花器官身份决定。
3.7. 蛋白互作分析
Y2H实验证明DnAGL6-2能与DnMYB1和DnSEP3发生蛋白互作，但DnAGL6-2与DnMYB2之间、DnSEP3与DnMYB1或DnMYB2之间均未检测到相互作用。
3.8. DnAGL6-2和DnSEP3的调控机制分析
Y1H实验表明，DnAGL6-2和DnSEP3能直接结合花青素生物合成途径（ABP）关键基因DnF3H、DnFLS和DnBZ1的启动子区域，但不能直接结合DnANS、DnMYB1或DnMYB2的启动子。
研究结论与讨论
本研究揭示了金钗石斛花被呈色由复杂的转录调控网络控制。该网络的核心特征在于转录因子间的协同与拮抗作用：在色斑区域，高表达的DnAGL6-2与特异性表达的DnMYB1发生协同互作，同时低表达的DnSEP3减少了对DnAGL6-2的拮抗（通过形成无活性的复合物），从而强力激活花青素合成基因（如DnF3H、DnFLS、DnBZ1）的表达，导致色斑形成。在非色斑区域，低表达的DnAGL6-2与高表达的DnSEP3形成拮抗，同时DnMYB2的特异性表达可能主导了该区域相对较浅的着色。这种由转录因子空间特异性分布、蛋白互作（协同与拮抗）以及对下游结构基因的直接调控共同构成的精细网络，最终决定了金钗石斛花被复杂而多样的颜色模式。该研究不仅深化了对兰花花卉颜色形成分子机制的理解，而且鉴定出的关键基因（如DnMYB1、DnAGL6-2）为通过基因工程手段精准调控兰花花色、培育新奇观赏品种提供了宝贵的遗传资源和理论依据。
