《Science of The Total Environment》：Development of a method for rapid and simultaneous detection of antibiotic resistance genes in wastewater using a portable quantitative PCR device
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本研究针对废水处理厂作为抗生素抗性基因（ARGs）关键储存库且传统qPCR检测存在设备依赖性强、耗时长的痛点，开发了基于PicoGene? PCR1100便携式qPCR仪的三重qPCR方法，实现了mecA、ampC和mcr-1基因的20分钟内快速同步检测。该方法灵敏度达6.4拷贝/反应，与常规qPCR性能相当，并通过优化聚乙二醇沉淀法和QIAamp DNA Mini Kit提取流程，在95%-100%的废水样本中成功检出目标基因（浓度4.6-6.5 log10拷贝/L），为环境ARGs监测提供了高效便携的技术支撑。
当细菌在抗菌药物的压力下发生基因突变，便会催生抗生素抗性基因（ARGs），这种被称为"抗菌素耐药性（AMR）"的现象已被世界卫生组织列为十大新兴公共卫生威胁之一。更棘手的是，废水处理厂（WWTPs）作为连接人类、动物和环境的重要枢纽，虽然能去除大部分污染物，却难以完全清除ARGs，反而成为抗性基因传播和水平转移的"热点区域"。传统定量PCR（qPCR）虽是检测ARGs的常用手段，但其对大型专业设备的依赖、高昂成本和耗时较长的特点，极大限制了现场快速监测的应用。如何在复杂的水体环境中实现ARGs的灵敏、快速及同步检测，成为阻断抗性基因传播链条的关键技术瓶颈。
为攻克这一难题，日本山梨大学的研究团队将目光投向了便携式qPCR设备PicoGene? PCR1100。这款仅手掌大小（200×100×50 mm）、重量560克的设备，通过微流控芯片和气压驱动样本在三个恒温区间循环的技术，将检测时间缩短至20分钟以内。研究人员以临床高耐药性代表的mecA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌标志基因）、ampC（β-内酰胺酶基因）及动物源性的mcr-1（黏菌素抗性基因）为靶点，在《Science of The Total Environment》发表了关于废水ARGs快速检测新方法的系统性研究。
关键技术方法包括：从两座污水处理厂采集27份进水样本，对比离心法与聚乙二醇（PEG）沉淀法的浓缩效果；评估QIAamp DNA Mini Kit与Cica Geneus DNA Extraction Reagent Kit两种DNA提取试剂盒的性能；采用单重与三重qPCR平行检测，并通过标准品稀释系列验证PicoGene?与常规qPCR系统的检测限（LOD）和定量限（LOQ）。
3.1 便携式与常规qPCR系统性能对比
通过系列稀释阳性对照验证，PicoGene?对mecA的LOQ和LOD均为6.4拷贝/反应，与常规qPCR完全一致；对ampC的LOQ/LOD为3.2拷贝/反应，略低于常规qPCR的1拷贝/反应，但仍在可接受范围。对实际废水样本的检测显示，两种平台对三种ARGs的检出率均达100%，浓度无显著差异（p>0.05），证实便携设备在复杂水体基质中仍保持可靠灵敏度。
3.2 单重与三重qPCR检测效能比较
三重qPCR的标准曲线线性良好（R2=0.990-0.999），斜率（-3.73至-3.48）和扩增效率（85.4%-93.8%）与单重qPCR高度一致。在废水样本中，除mcr-1在三重检测中检出率略降为88%外，其余基因均保持100%检出，且浓度无统计学差异（p>0.05），证明同步检测未牺牲准确性。
3.3 样本前处理方法优化
PEG沉淀法对ampC的回收效率显著高于离心法（6.3±0.3 vs 6.1±0.3 log10拷贝/L，p<0.05），推测因该基因可能存在于外膜囊泡等细胞外组分中，而PEG可更有效富集此类微小颗粒。DNA提取环节中，QIAamp试剂盒对低浓度mecA的检出率（100%）明显优于Cica Geneus试剂盒（60%），凸显了纯化步骤对抑制物去除的重要性。
3.5 三重qPCR在废水监测中的应用
采用优化流程（PEG沉淀+QIAamp提取）对19份废水进行监测，结果显示mecA和ampC检出率达100%，mcr-1为95%，浓度范围分别为4.6±0.5、6.5±0.2和5.6±0.6 log10拷贝/L。其中mecA浓度波动最大，可能与其在三重检测中易受干扰有关。
3.6 ARGs与粪便指示菌相关性分析
大肠杆菌（E. coli）和总大肠菌群浓度与三种ARGs均无显著相关性（p>0.05），提示ARGs宿主菌群可能不同于传统粪便指示菌，需进一步结合特异性菌株标记进行溯源。
研究结论表明，PicoGene?凭借其微流控技术优势，在保持与常规qPCR相当灵敏度的同时，将检测时间从数小时压缩至20分钟，并首次实现废水中多重ARGs的实时同步定量。该方法为WWTPs的工艺优化评估、医院或养殖场排污的现场监测提供了技术支撑，尤其适用于资源有限地区的AMR快速筛查。尽管设备通量限制和微流控芯片操作要求仍是推广难点，但通过优化温度参数扩展检测靶标（如blaNDM-1、int1基因），结合宿主菌追踪，将有望构建更完善的ARGs传播预警体系。这项研究为践行"一体化健康"（One-Health）策略提供了可落地的技术方案，使环境水体中的抗性基因监测从实验室走向现场成为可能。
