《Scientia Horticulturae》：Genome-wide identification and functional analysis of
UGT genes reveal multiple flavonoid 3-O-glycosyltransferases synergistically enhancing cold tolerance in
Allium fistulosum
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本研究针对葱属植物（Allium fistulosum）如何响应低温胁迫以增强其抗寒性的科学问题，系统开展了全基因组范围内UDP-糖基转移酶（UGT）基因家族的鉴定与功能分析。研究成功鉴定出124个AfUGT基因，并通过整合转录组学、代谢组学和瞬时表达功能验证，揭示了AfUGT24、AfUGT25和AfUGT89作为黄酮3-O-糖基转移酶的关键作用，其协同上调可显著提高糖基转移酶活性和黄酮含量，从而增强植物的抗氧化防御能力和耐寒性。该研究为葱属作物抗寒分子育种提供了重要的基因资源和理论依据。
在园艺产业中，葱属作物具有重要的经济价值，但其生长常常受到低温等非生物胁迫的威胁。低温会诱导植物体内活性氧（ROS）的积累，造成氧化损伤。为了应对这种胁迫，植物进化出了复杂的防御机制，其中，黄酮类化合物作为核心的抗氧化剂，在植物次生代谢中扮演着至关重要的角色。然而，黄酮类物质需要在UDP-糖基转移酶（Uridine diphosphate-glycosyltransferases, UGTs）的催化下进行糖基化修饰，才能增强其稳定性和生物活性，从而更有效地发挥抗氧化功能。尽管UGT基因家族在其他植物中已有较多研究，但在分葱（Allium fistulosum）这一重要葱属作物中，其家族成员的全貌、功能及其在低温胁迫响应中的作用仍不清晰。这限制了我们利用基因工程手段提升分葱抗寒能力的潜力。为此，发表在《Scientia Horticulturae》上的这项研究，旨在全面解析分葱UGT基因家族，并挖掘其在黄酮代谢和低温耐受性中的关键成员。
为了开展这项研究，研究人员运用了多项关键技术。他们首先从数据库获取了分葱的基因组数据，利用隐马尔可夫模型（HMM）进行全基因组范围的UGT基因鉴定。通过系统发育分析、基因结构和保守基序分析、染色体定位和共线性分析，对AfUGT基因家族进行了生物信息学层面的系统表征。此外，研究还结合了已发表的转录组数据（RNA-seq）和本研究进行的非靶向代谢组学分析（LC-QTOF-MS），来探究基因表达与代谢物积累的关联。为了验证候选基因的功能，研究采用了农杆菌介导的烟草瞬时表达技术。最后，通过定量实时聚合酶链式反应（qPCR）和生化试剂盒，分别在基因转录水平和酶活性/代谢物水平上监测了分葱幼苗在低温（10°C）处理下的动态响应。
3.1. 分葱UGT基因家族的鉴定和系统发育分析
研究人员利用PF00201的HMM模型在分葱基因组中鉴定出124个非冗余的AfUGT基因。这些基因编码的蛋白大小、等电点等理化性质各异，亚细胞定位预测显示其主要定位于叶绿体和细胞质。通过构建最大似然系统发育树，并将这些AfUGT与拟南芥等物种中已功能鉴定的UGT进行比对，发现它们可被划分为18个进化组（A-R），其中D组出现了显著的扩张，而H组缺失。这表明分葱UGT家族在进化过程中发生了谱系特异性的分化。
3.2. 基因结构和保守基序分析
对AfUGT基因的结构分析发现，45.2%的基因没有内含子，38.7%含有一个内含子，其余基因含有2至13个不等的内含子。保守基序分析识别出10个基序，其在不同AfUGT蛋白中的数量和排列顺序存在差异，暗示了该基因家族功能的多样性。
3.3. 染色体分布和同线性分析
124个AfUGT基因在分葱的8条染色体上呈不均匀分布，其中3号染色体上的基因数量最多。基因重复事件分析仅发现一对片段重复基因，表明串联重复可能是分葱UGT基因家族扩张的主要驱动力。与水稻和玉米的同线性比较发现，分葱与水稻之间存在更多的直系同源基因对，提示二者亲缘关系更近。
3.4. AfUGT基因家族顺式作用元件分析
对AfUGT基因启动子区（转录起始位点上游2000 bp）的分析揭示了丰富的顺式作用元件，这些元件可分为四类：植物激素响应元件（如脱落酸ABA、茉莉酸甲酯MeJA响应元件）、胁迫响应元件（如低温响应元件LTR、干旱诱导MYB结合位点MBS）、生长发育相关元件和光响应元件。绝大多数（92.7%）的AfUGT基因启动子区都含有至少一种胁迫响应元件，强烈暗示该家族广泛参与非生物胁迫响应。
3.5. 通过整合转录组学和代谢组学分析鉴定参与黄酮生物合成的UFGT
对分葱茎和叶组织的转录组分析显示，AfUGT基因的表达具有显著的组织特异性，部分基因在叶片中高表达，部分在茎中高表达。代谢组学分析则鉴定出157种黄酮代谢物，其中93种在茎叶间存在显著差异积累，特别是黄酮3-O-葡萄糖苷衍生物在叶片中富集。这一结果与叶片中多个AfUGT基因高表达的现象相吻合。进一步的系统发育分析将AfUGT24、AfUGT25、AfUGT89和AfUGT92归类到与黄酮3-O-糖基化相关的3GT进化枝中。
3.6. UGT基因在本氏烟中的瞬时表达
为了功能验证，研究人员将这四个候选基因在本氏烟叶片中进行瞬时过表达。结果显示，与对照相比，过表达AfUGT24、AfUGT25和AfUGT89能显著提高烟草叶片中的糖基转移酶活性和总黄酮含量，而过表达AfUGT92则无此效果，初步证明了前三个基因具有功能活性。
3.7. AfUGT候选基因对低温胁迫的响应
在低温（10°C）胁迫下，分葱幼苗中AfUGT24、AfUGT25和AfUGT89的表达量被显著上调，而AfUGT92的表达则下调，这表明它们在应对低温胁迫时受到不同的调控。
3.8. 低温胁迫下叶片中黄酮糖基转移酶活性和黄酮含量的检测
对低温处理的分葱叶片进行时间进程分析发现，糖基转移酶（UFGT）活性和总黄酮含量随胁迫时间延长而显著增加，并在第5天达到峰值。相关性分析表明，酶活性与黄酮含量之间存在显著正相关（r = 0.82, P < 0.05），说明低温诱导的UGT基因表达上调可能直接促进了黄酮的糖基化和积累。
综合讨论与结论表明，本研究首次在分葱中完成了UGT基因家族的全基因组鉴定和系统分析。通过多组学整合和功能验证，揭示了AfUGT24、AfUGT25和AfUGT89是参与黄酮3-O-糖基化的关键基因，并且在低温胁迫下被协同诱导表达。这种协同上调通过增强糖基转移酶活性，驱动了具有更强抗氧化能力的黄酮糖苷的合成与积累，从而强化了分葱的抗氧化防御系统，最终提升其耐寒性。该研究不仅为理解葱属植物黄酮代谢的调控机制提供了新的分子见解，而且为培育高抗寒性的葱属作物品种提供了宝贵的候选基因资源，具有重要的理论和应用价值。
