《npj Regenerative Medicine》：Engraftment of wild-type alveolar type II epithelial cells in surfactant protein C deficient mice
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本研究针对儿童间质性肺病（chILD）缺乏有效治疗手段的临床难题，开展了肺泡Ⅱ型上皮细胞（ATII）移植治疗表面活性蛋白C（SP-C）缺陷所致肺纤维化的探索。研究人员通过低剂量博来霉素预处理SP-C缺陷（Sftpc-/-）小鼠模型，成功植入野生型ATII细胞，发现移植细胞可长期存活并分泌成熟SP-C，显著改善博来霉素诱导的肺损伤。该研究为chILD的细胞疗法提供了概念验证，为替代肺移植提供了新思路。
儿童间质性肺病（chILD）是一类由肺表面活性物质功能障碍引起的罕见而严重的慢性肺部疾病，其中表面活性蛋白C（SP-C）编码基因SFTPC的突变是重要病因之一。肺表面活性物质由肺泡Ⅱ型上皮细胞（ATII）合成和分泌，其主要功能是降低肺泡表面张力，防止呼气末肺泡塌陷。当SFTPC发生突变时，会导致SP-C蛋白表达缺失或功能异常，进而引发ATII细胞功能障碍、肺泡结构异常和进行性肺纤维化。目前，除了支持治疗外，肺移植是唯一可能根治的手段，但供体短缺、手术风险高以及术后长期存活率不理想（五年存活率仅约57.5%）等问题，限制了其临床应用。因此，开发新的治疗策略迫在眉睫。
细胞治疗为chILD提供了新的希望。理论上，通过移植正常的或经过基因校正的ATII细胞，可以替代患者体内有缺陷的ATII细胞，恢复表面活性物质的正常产生，从而逆转或延缓疾病进程。然而，这一设想面临诸多挑战：如何使移植细胞在受体肺内有效植入并长期存活？需要替换多少缺陷细胞才能产生治疗效果？治疗的最佳时机是什么？为了回答这些问题，研究团队选择Sftpc基因敲除（Sftpc-/-）小鼠作为疾病模型，开展了一项概念验证性研究，相关成果发表在《npj Regenerative Medicine》上。
为了评估细胞治疗的可行性，研究人员主要运用了几项关键技术：首先，他们建立了Sftpc-/-小鼠的疾病进展时间线，通过组织学、立体计量学和胶原蛋白定量等方法，系统评估了小鼠随年龄增长出现的肺损伤和纤维化变化。其次，他们利用不同剂量的博来霉素诱导急性肺损伤，以模拟疾病急性加重并测试小鼠的敏感性。第三，他们从野生型（Sftpc+/+）小鼠肺中分离和纯化了原代ATII细胞，并通过流式细胞术和免疫荧光染色验证其纯度和活力。最后，他们通过气管内注射将野生型ATII细胞移植到经博来霉素预处理的Sftpc-/-小鼠肺中，并利用免疫荧光染色、RT-qPCR（检测Sftpc mRNA）以及针对Sftpc基因外显子2的基因组DNA（gDNA）qPCR分析，多维度地定量评估了移植细胞的植入效率、长期存活情况以及功能状态（如成熟SP-C的产生）。此外，还通过盲法病理评分（LIS）和损伤区域定量（SI-ROIs/LI-ROIs）来评估移植治疗对肺损伤的修复效果。
Morphological changes of the lung in Sftpc-/-mice
研究人员首先系统分析了Sftpc-/-小鼠随年龄增长的肺部病理变化。与同龄野生型（Sftpc+/+）小鼠相比，Sftpc-/-小鼠从4月龄开始就表现出进行性加重的肺损伤，包括肺泡间隔增厚、中性粒细胞浸润、肺泡腔内蛋白样 debris 积聚。肺损伤评分（LIS）和严重损伤区域（SI-ROIs）百分比均显著升高。立体计量学分析进一步揭示了肺泡间隔数量、体积密度、平均横截壁长度等参数的异常，表明存在纤维化重塑过程。此外，胶原蛋白I和IV的沉积、羟脯氨酸含量以及波形蛋白阳性细胞均随年龄增加而显著增多，证实了纤维化的进展。更重要的是，从Sftpc-/-小鼠分离的ATII细胞不仅缺乏SP-C，其关键标志物如Abca3、Lamp3和Nkx2.1的mRNA表达也显著降低，同时伴有ATII细胞增生，这些发现共同说明SP-C的缺失导致了ATII细胞的内在缺陷和肺部病理性改变，成功模拟了chILD的关键特征。
Increased susceptibility to bleomycin in Sftpc-/-mice
为了给细胞移植创造“生态位”，研究团队测试了Sftpc-/-小鼠对博来霉素的敏感性。结果显示，即使是低剂量（0.005 U/只）的博来霉素也能在Sftpc-/-小鼠中引起显著的肺泡壁增厚、炎症和蛋白沉积，而野生型小鼠仅在较高剂量（0.01-0.05 U/只）下才出现明显损伤。Sftpc-/-小鼠在所有剂量下的LIS和SI-ROIs均显著高于野生型对照。胶原沉积和羟脯氨酸含量分析也证实了其更强的纤维化反应。有趣的是，尽管ATII细胞标志物mRNA水平下降，但在高剂量博来霉素处理后，Sftpc-/-小鼠肺中Lamp3阳性细胞数量却显著增加，提示缺陷的ATII细胞可能试图进行代偿性增殖，但这种反应可能失调并加剧纤维化。这一部分研究表明，Sftpc-/-小鼠对博来霉素高度敏感，低剂量博来霉素即可造成足够的肺上皮损伤而不引起毁灭性打击，这为后续细胞移植提供了合适的预处理条件。
Engraftment of syngeneic Sftpc+/+ATII cells in bleomycin-conditioned Sftpc-/-mice
研究核心是评估野生型ATII细胞的植入情况。研究人员将纯化后的Sftpc+/+ATII细胞（纯度>95% EPCAM+CD45-）移植到经不同剂量博来霉素预处理的4、8、12月龄Sftpc-/-小鼠体内。移植后14天的分析显示，低剂量博来霉素（0.005 U/只）预处理组的小鼠，其肺内移植细胞的植入效率最高，通过pro-SPC免疫荧光染色、Sftpc mRNA和gDNA检测均得到一致证实。移植细胞位于肺泡区域，并与ATI细胞（RAGE标记）相邻，表明其整合到了正常的解剖结构中。相比之下，未预处理或高剂量博来霉素预处理的小鼠植入效果很差。此外，年轻小鼠（4月龄）的植入效率显著高于年老小鼠（12月龄），提示早期干预的重要性。
Long-term engraftment and functionality of Sftpc+/+ATII cells
最后，研究评估了移植细胞的长期存活、功能及治疗效应。在移植后长达8周的时间内，仍能在受体肺中检测到pro-SPC阳性的移植细胞。关键的是，通过共聚焦显微镜观察，发现这些植入的野生型ATII细胞（Lamp3+/pro-SPC+）能够表达成熟的SP-C，证明它们不仅存活，而且恢复了合成和加工表面活性蛋白的关键功能。在治疗效果方面，移植后4周，与仅接受博来霉素和模拟细胞注射的对照组相比，接受ATII细胞移植的小鼠肺损伤评分（LIS）显著改善，严重损伤区域（SI-ROIs）减少，而轻度损伤区域（LI-ROIs）增加。到8周时，虽然与博来霉素损伤组相比仍有改善趋势，但相较于未损伤的疾病自然进展组，统计学差异不再显著，提示单次细胞移植可能难以完全阻止疾病的长期慢性进展，但其在损伤急性期的修复作用是明确的。
综上所述，这项研究首次在模拟chILD的Sftpc-/-小鼠模型中，成功证明了野生型ATII细胞移植的可行性。低剂量博来霉素预处理能有效促进移植细胞植入，植入的细胞能够长期存活并发挥功能（产生成熟SP-C），并能显著减轻博来霉素诱导的急性肺损伤。研究强调了治疗时机的重要性，早期干预效果更佳。虽然博来霉素作为预处理剂在临床转化中存在限制，但该研究为基于ATII细胞的再生医学治疗chILD提供了强有力的概念验证和 preclinical 平台。未来研究可探索更安全的预处理方案、具有更强再生潜能的ATII细胞亚群（如Wnt信号响应的Axin2+细胞）或干细胞来源的肺上皮祖细胞，以及多次移植策略，以期实现更持久、更有效的疾病控制。这项工作为最终开发出替代肺移植的细胞疗法迈出了关键一步。
