《npj Viruses》：In vitro synthesis of active recombinant orthoflavivirus nonstructural polyproteins in detergent micelles for biochemical analysis
编辑推荐：
本研究针对正黄病毒非结构多蛋白在复制复合体组装中的生化机制不清等问题，开发了一种基于小麦无细胞蛋白合成系统的体外重组多蛋白合成策略。通过在DDM去垢剂胶束中合成登革病毒NS1-5多蛋白，首次实现了其自切割及NS3蛋白酶/解旋酶、NS5 RdRp等关键酶活性的功能性重建，证实多蛋白切割以顺式分子内机制为主。该体系为解析黄病毒复制机制及药物靶点筛选提供了新工具。
黄病毒家族中的登革病毒、寨卡病毒等通过单股正链RNA编码的多蛋白前体，经宿主与病毒蛋白酶切割后形成病毒复制复合体。然而，由于多蛋白分子量大（约300 kDa）、跨膜结构域多，其体外合成与功能研究一直面临技术瓶颈。传统细胞表达系统难以获得完整且有活性的多蛋白复合物，且无法实时观察切割过程。为此，研究团队建立了一种创新性体外重建策略。
本研究核心采用小麦胚无细胞蛋白合成系统，通过优化去垢剂DDM（n-dodecyl-β-D-maltoside）浓度，成功合成登革病毒2型（DENV-2）包含NS1至NS5的全长非结构多蛋白（NS1-5）。关键技术包括：1）利用pEU载体构建多蛋白表达质粒；2）通过添加DDM形成胶束环境模拟膜结构；3）结合免疫印迹、GST pull-down、蛋白酶/ATP酶/RdRp活性检测等多手段验证功能；4）通过时间梯度实验与突变体（如蛋白酶活性缺失突变S835A）对比阐明切割机制。
多蛋白合成与切割机制
在DDM存在下，NS1-5多蛋白可高效完成自切割，产生成熟NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5（图1c）。离心实验显示切割后的蛋白复合物主要存在于沉淀组分，提示其与DDM胶束结合（图1d）。值得注意的是，NS1-NS2A连接处未被病毒蛋白酶切割，形成NS1-NS2A融合蛋白，团队进一步通过共合成NS1单独蛋白与NS2A-5多蛋白（NS1&2A-5）解决此问题（图2a-b）。
蛋白相互作用与酶活性验证
GST pull-down实验证实NS1与NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5存在相互作用（图2c）。酶活检测显示：1）NS3蛋白酶可水解荧光底物Bz-Nle-Lys-Arg-Arg-AMC（图3a）；2）NS3解旋酶结构域具有ATP水解活性（图3b）；3）NS5能以病毒RNA模板启动de novoRNA合成（图3c）。NS1&2A-5的RdRp活性高于NS1-5，可能因较短多蛋白更易合成活性NS5。
切割模式与动力学分析
通过混合AGIA标记的S835A突变体（底物）与野生型多蛋白（蛋白酶），发现底物多蛋白几乎不被反式切割，而野生型自身可发生顺式切割（图4b-d）。时间进程实验显示，多蛋白合成1小时后即出现切割产物，且切割产物随时间累积而全长蛋白增加缓慢（图4e），证明切割以共翻译或翻译后立即发生的顺式机制为主。
体系普适性验证
该技术成功扩展至寨卡病毒（ZIKV）和蜱传脑炎病毒（TBEV），DDM同样显著促进其多蛋白切割（图5），表明该方法适用于多种正黄病毒研究。
本研究首次在体外重建了具有酶活性的黄病毒多蛋白复合物，揭示了其以顺式切割为主导的生化特性。DDM胶束环境有效模拟了内质网膜的疏水环境，使跨膜蛋白正确折叠。尽管体系尚未包含宿主信号肽酶（导致NS1-NS2A、2K-NS4B连接处未完全切割）和病毒RNA等要素，但为解析复制复合体组装机制、筛选靶向蛋白相互作用的抗病毒药物（如NS3-NS4B抑制剂）提供了新平台。未来通过整合宿主因子与病毒RNA，有望实现完全功能性复制复合体的体外重构。
