通过拉曼微光谱技术研究质子疗法和化放疗对耐辐射前列腺癌细胞生化特性的影响

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Effect of proton therapy and chemoradiotherapy on biochemistry of radioresistant prostate cancer cells studied by Raman microspectroscopy

质子放疗联合化疗增敏剂处理耐药性前列腺癌细胞，通过Raman显微光谱结合PLSR回归和随机森林分类分析，发现放疗后细胞蛋白质与核酸比例差异显著，联合治疗提升疗效且分类模型准确度高。

　　

Maciej Roman | Tomasz P. Wrobel | Agnieszka Panek | Danuta Liberda-Matyja | Wojciech M. Kwiatek

波兰科学院核物理研究所，Radzikowskiego 152号，31-342克拉科夫，波兰

摘要

放射治疗是一种有效的抗癌治疗方法，因为它具有局部作用且副作用较少。如今，由于质子治疗的优势（包括不依赖于肿瘤的氧气供应以及在穿透路径末端释放能量——即布拉格曲线），它已成为比基于光子的放射治疗更常见的选择。然而，放射治疗的效果受到被照射细胞放射抵抗性的限制。为克服这一限制，已经提出了几种方法，包括使用放射增敏剂——这些分子能够选择性地增强放射对癌细胞的杀伤作用。这种联合疗法（化疗放疗）提高了抗癌治疗的效率，从而增加了患者的生存率。然而，化疗放疗在癌细胞中引起的生化变化在亚微观尺度上仍未得到充分研究。在本研究中，使用拉曼显微光谱技术监测了接受质子治疗和质子与选定的放射增敏剂（C75、水飞蓟素）联合治疗的放射抵抗性前列腺癌细胞中的这些变化。由于放射诱导的效果非常微弱，分析过程中还采用了统计方法（偏最小二乘回归、随机森林分类）。我们的结果显示，细胞对质子治疗的整体反应与对X射线治疗的反应相似。然而，详细分析表明这两种放射治疗方式下的蛋白质与核酸比例存在差异。最后，化学计量分析表明细胞对化疗、放疗和化疗放疗的反应存在明显差异，这一点通过随机森林分类的结果得到了验证。

引言

癌症仍然是一个严重的健康问题，全球每年约有2000万新病例[1]。在男性中，前列腺癌是最危险的癌症之一。多年来，前列腺癌一直是男性中第二常见的癌症（约150万新病例，占所有癌症病例的14.2%），每年约有40万人因此死亡（占所有癌症病例的5%，7.3%）[1]。迄今为止，已经提出了多种治疗前列腺癌的方法，包括手术、化疗、姑息治疗和放射治疗。如今，越来越多地采用这些方法的组合来提高治疗效果。放射治疗已成为最广泛使用的非手术癌症治疗方法之一[2]，旨在靶向恶性细胞的同时将对周围健康组织的伤害降到最低。这种癌症治疗方法使用电离辐射（通过X射线或质子外部照射，或通过近距离放射治疗内部照射），对关键细胞结构（尤其是DNA）造成严重损伤。这会导致细胞通过凋亡和有丝分裂相关途径死亡，以及失去生殖能力[3]。

基于外部束流的放射治疗通常使用光子来引起辐射损伤。光子在穿透路径上分布其能量——治疗剂量在患者入口点下方急剧增加，在肿瘤区域内达到峰值，然后几乎呈指数级逐渐下降[4]。这一特性导致肿瘤组织附近的健康器官受到不必要的照射。对于某些器官（例如心脏和肺部）来说，这种附带后果尤其危险，尤其是在乳腺癌治疗中[4]。此外，由于氧气是一种强效的放射增敏剂，光子放射治疗的一个主要限制是缺氧现象，而这在实体瘤中很常见。鉴于这些缺点，使用带电粒子（质子、碳离子）的放射治疗被提议作为更好的癌症治疗方法。质子显示出独立于肿瘤氧气供应的抗癌效果，并且在穿透路径末端释放大部分能量（即布拉格曲线）。因此，能量在肿瘤体积内部局部释放，从而保护了相邻的健康组织免受辐射损伤。这一优势使得质子放射治疗在某些类型癌症的治疗中比基于光子的放射治疗更具优势[5]。

尽管现代放射治疗非常有效，并显著改善了治疗效果，但它仍然面临被照射细胞产生放射抵抗性的问题[6]。放射抵抗性是指癌细胞适应电离辐射并对其效果变得不那么敏感的能力。这一复杂现象涉及许多基因、生物因素和分子机制，如异常的血管系统、缺氧、葡萄糖和能量短缺，以及基因表达和蛋白质组成的改变[6],[7]。由于放射抵抗性的出现与细胞代谢密切相关[7],[8]，因此已经探索了许多分子或抑制剂（天然[9],[10]和合成[11]药物）来针对特定的代谢途径或分子。其中许多药物成功地作为放射增敏剂发挥作用，选择性地增强放射对癌细胞的杀伤作用[12]。例如C75是一种合成的cerulenin类似物，是一种强效的脂肪酸合成酶（FAS）抑制剂，已被广泛研究作为抗癌剂[13],[14],[15]。研究表明，C75能有效提高前列腺癌细胞对电离辐射的敏感性[16],[17],[18]。另一种著名的放射增敏剂是水飞蓟素（SB）[19],[20]，它是一种来自奶蓟种子的黄酮木脂素家族的天然酚类物质。SB具有多种生物学作用，包括抑制脂质和糖酵解代谢、胆固醇合成以及抑制多种信号通路和转运蛋白[21],[22],[23],[24],[25],[26]。尽管水飞蓟素已进入临床试验阶段，但结果表明，尽管它在血液中的浓度较高，但在前列腺组织中的积累量相对较低[26],[27],[28],[29]。

从物理和生物学的角度来看，辐射损伤和放射抵抗性已经进行了数十年的研究[3],[30],[31],[32],[33],[34]。然而，大多数实验研究采用生化测定、色谱法或染色技术[35]。由于这些生化方法通常需要添加外部因素或破坏样品，因此越来越多的研究开始使用无标记和非破坏性的振动光谱技术，即红外（IR）和拉曼光谱。这些技术可以在不对样品组成造成太大影响的情况下，监测电离辐射在生物材料中引起的微小分子变化[36]。这使得能够识别主要由辐射引起的细胞内生化变化，同时显著减少所采用方法的影响。拉曼显微光谱特别适合于识别和表征被照射细胞中的复杂生化变化，因为它具有亚微米级的空间分辨率和丰富的信息（拉曼光谱包含许多窄带）。可以在样品体积内同时分析多种分子（蛋白质、脂质、核酸、碳水化合物），从而相对地表达辐射引起的变化。这可以在治疗过程中提供有价值的信息，根据测量的辐射反应调整或改变患者的治疗策略。这些信息还可以用于评估治疗效果和被治疗癌症的放射抵抗性。在我们之前的论文[37],[38],[39],[40],[41]以及其他研究人员[42],[43],[44],[45],[46],[47],[48],[49],[50],[51],[52]中，已经通过拉曼光谱广泛研究了癌细胞和组织的辐射损伤。然而，迄今为止只有少数关于质子引起的细胞和组织辐射损伤的IR和拉曼研究[4],[48],[53],[54],[55],[56]。此外，目前还没有关于质子和X射线引起的癌细胞生化变化的光谱比较。在这项工作中，使用拉曼显微光谱技术研究了接受质子照射的放射抵抗性PC-3前列腺癌细胞的生化变化，并将其结果与X射线治疗细胞的结果进行了比较。此外，还揭示了质子和放射增敏剂联合治疗对PC-3细胞的影响，并将其与质子单治疗的反应进行了比较。由于未经处理和经照射细胞之间的光谱差异很小，研究数据量很大，而且细胞代谢（如细胞周期阶段）对光谱变异性有很大影响，因此采用了偏最小二乘回归（PLSR）等化学计量方法来辅助数据解释。最后，对采用不同方法（无治疗、X射线、质子、放射增敏剂和联合治疗）处理的细胞的拉曼光谱进行了随机森林（RF）分类，以探索拉曼光谱在准确检测治疗类型方面的潜力。

部分内容

细胞培养

人类前列腺腺癌细胞PC-3（ATCC）最初来源于骨转移，培养于添加了10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素-链霉素-新霉素溶液、10 mM HEPES和1 mM丙酮酸的RPMI 1640培养基中（Sigma Aldrich，德国Steinheim）。培养物在含有5% CO₂的湿润培养箱中维持在37°C。

照射程序

细胞培养在放置在Petri培养皿中的氟化钙（CaF₂）窗口上（Crystran Ltd., 英国），并在其中进行培养

低剂量和高剂量质子引起的生化变化

在我们之前的研究中，广泛使用拉曼显微光谱技术来研究PC-3细胞在暴露于低剂量（高达10 Gy）和高剂量（10–50 Gy）X射线辐射后发生的生化变化[37],[38],[41]。在本研究中，我们使用质子作为电离辐射源来研究照射后的细胞生化变化。与基于光子的放射治疗类似，实验中的细胞也接受了低剂量

结论

在本研究中，结合统计方法应用了拉曼光谱技术，以检测接受质子照射的放射抵抗性前列腺癌细胞在放射治疗和化疗放疗后发生的微妙生化变化。计算出的PLSR模型表现出良好的性能，证实了所提出方法在检测处理后细胞拉曼光谱微妙变化方面的有效性。回归系数（β）图显示了细胞之间的相似性

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作部分得到了波兰国家科学中心（资助编号2015/19/D/ST4/01943）和波兰科学与高等教育部项目的支持：“利用国家同步辐射中心SOLARIS的研究基础设施进行研究和开发”，合同编号1/SOL/2021/2。研究使用了在该项目框架内购买的设备，该项目还得到了Malopolska地区运营计划Measure 5.1 Krakow的共同资助