《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Label-free Raman spectroscopy combined with artificial intelligence for functional subtyping of human sperm and prediction of embryo development outcomes
编辑推荐：
单细胞无标记拉曼光谱结合AI技术成功评估精子功能并预测辅助生殖技术（ART）临床结果，发现两组精子光谱亚型与2PN受精率（76.08% vs 50.17%, P=0.044）、优质胚胎率（40.53% vs 17.57%, P=0.010）及囊胚形成率（59% vs 9%, P<0.001）显著相关，GRU模型预测准确率达94%。
高博阳|张宁|毕德熙|赵海静|朱玉琴|曾文峰|聂艳|陈建宁|欧阳能勇
广东省恶性肿瘤表观遗传学与基因调控重点实验室，粤港澳大湾区RNA医学联合实验室，中山大学孙逸仙纪念医院乳腺肿瘤中心，中国广州510120
摘要
拉曼光谱技术能够实现无标记、非破坏性的单细胞测量，并直接检测核酸、蛋白质和脂质的内在生化信号。传统的精液分析方法在辅助生殖技术（ART）中的预测能力有限。我们开发了一种结合人工智能（AI）的单细胞、无标记拉曼分析流程，用于评估精子的功能状态并预测ART的结果。通过对31名ART患者的精液样本进行光谱分析，提取了与核酸、蛋白质、脂质和糖原相关的诊断信息。光谱分析区分出了两种不同的精细胞群：具有更高染色质完整性、更有利的蛋白质构象以及更好膜脂质动态特性的细胞群与更好的妊娠结果相关，具体表现为更高的双核（2PN）受精率（76.08% vs 50.17%，P = 0.044）、高质量胚胎率（40.53% vs 17.57%，P = 0.010）和囊胚形成率（59% vs 9%，P < 0.001）。在评估的各种分类模型中，门控循环单元（GRU）模型表现出最佳的预测性能（准确率94%，敏感性94%，AUC 0.98）。这种拉曼-AI检测方法能够客观、无创地对精子质量进行分层，并提供临床相关的预后信息，为ART中的精准精子选择提供了严谨的分析工具。
引言
据估计，全球约有8%–12%的育龄夫妇存在不孕问题，其中男性因素占一半以上，可能单独起作用或与女性因素共同作用[1]、[2]。男性不育是一个重大的全球健康挑战，影响着全球约3000万男性。除了生物学影响外，不孕还对患者和医疗系统造成巨大的心理和社会压力[3]、[4]。尽管ART是这些夫妇的标准治疗方法，但总体活产率仍然很低，仅为30–40%，这主要是由于胚胎质量不佳、着床率低和流产率高等原因[5]、[6]。目前广泛使用基于世界卫生组织（WHO）指南的常规精液分析（SA）来评估精子质量。然而，传统的参数（如浓度、活力和形态）在预测受精能力和胚胎发育潜力方面的能力有限。基于群体平均值的评估方法掩盖了单个精子的分子异质性，可能忽略了最终到达卵子的少数精子的功能能力。此外，不同实验室对WHO协议的执行程度差异很大（美国的合规率低于60%，英国低于5%），进一步降低了SA在结果预测中的临床实用性[7]、[8]。这些局限性凸显了需要基于内在分子特征的更精确和客观的精子评估方法。
已经有许多方法用于评估精子质量，包括DNA片段指数（DFI）的检测，如精子染色质分散（SCD）测试、彗星试验、末端脱氧核苷酸转移酶dUTP标记（TUNEL）和精子染色质结构分析（SCSA）[9]、[10]、[11]。这些方法本质上具有破坏性，且在常规预测ART结果方面的价值有限。另一方面，一些最新研究表明，DFI升高并不会显著影响IVF/ICSI的妊娠结果[12]、[13]、[14]、[15]。其他高空间分辨率的技术（如电子显微镜、X射线成像、二次离子质谱）要么会损坏样本，要么无法同时提供精细的结构和化学信息[16]、[17]、[18]。临床上迫切需要可靠、无创且不破坏性的技术，能够在保持精子活力的同时提供精确的精子质量信息。
为了克服传统诊断方法的局限性，研究越来越关注具有单细胞分辨率的分子谱型技术。拉曼光谱技术通过探测非弹性散射，能够快速、无标记地实现对多组分生物样本的定性和定量分析。不同类型的细胞表现出独特的光谱“指纹”，反映了核酸、蛋白质、脂质和碳水化合物的特征，从而可以敏感地检测到微妙的生化变化[19]、[20]。拉曼光谱技术已应用于多种临床场景，包括细胞研究、癌症检测和血清分析[21]、[22]、[23]、[24]。在生殖医学领域，拉曼光谱技术可以捕获精子的高分辨率“化学指纹”，且不会影响精子活力，越来越多的证据表明它可以区分正常和具有功能的精子。先前的研究包括使用拉曼光谱和主成分分析（PCA）对牛精液进行无创性别鉴定[25]；通过DNA含量差异区分非整倍体和整倍体胚胎[26]；检测由X射线和Y射线引起的DNA损伤以及由马来酸引起的线粒体损伤[28]、[29]；以及在体外区分人类生精小管中的完全和不完全精子发生过程，并选择能结合透明带的精子[30]、[31]。这些发现共同支持了拉曼光谱技术作为评估精子质量的一种有前景的无创方法。
将人工智能（AI）与拉曼光谱技术结合使用，进一步带来了自动化、客观性和可重复性的优势，同时减少了操作者的依赖性[32]。将拉曼数据与机器学习算法结合已成为精子评估的重要方向[33]。从线性降维到深度学习（如循环神经网络和门控循环单元）的方法在精子亚型分类、受精潜力预测和ART中的分层策略方面表现出色[34]。例如，无标记拉曼光谱结合AI已被用于利用人工神经网络量化DNA化学突变并预测核苷酸组成[35]。尽管取得了这些进展，许多拉曼研究仍受到样本量小、临床转化能力有限和模型可解释性不足的制约。目前仍缺乏一个完整的“光谱特征–生物功能–临床结果”框架。
为了解决这些问题，我们开发了一个基于单细胞、无标记拉曼光谱技术的AI驱动分析框架。该框架旨在解析人类精子的生化异质性，并预测临床相关的ART结果。我们认为，拉曼光谱亚型可以作为反映精子生殖潜力的分子表型，为临床实践中的个性化精子选择提供无创、智能的工具。
研究人群和精液采集
共有31名男性患者参与了研究。所有参与者在样本采集前3–7天内禁欲。新鲜精液通过自慰获得，并在室温（22–25°C）下液化30分钟。每个样本的精液经过处理后保存在培养基中，处理后的精子浓度各不相同（大约为1–10×10^7个精子/mL）。精液分析按照WHO实验室手册进行
患者的基线人口统计学特征和常规精液分析
对31名男性的精液进行了处理，并选取了常规精液参数。表1总结了基线人口统计学特征和生殖特征，包括年龄、精子浓度、前向运动能力、取卵数量和MII期卵子数量、AMH水平、受精率、高质量胚胎率、囊胚形成率以及异常受精情况。精子的代表性明场图像（补充图S1）显示精子形态完整
讨论
我们的研究表明，将无标记拉曼光谱与AI结合使用可以无创地解析人类精子的生化异质性，并将光谱亚型与临床相关的胚胎学结果联系起来。我们发现了两种通过形态学或常规精液分析无法识别的离散光谱表型。
我们工作的关键贡献在于建立了精子光谱亚型与下游临床结果之间的直接关联
结论
据我们所知，这是首次直接利用精子拉曼光谱谱型来预测ART结果的研究。我们将无标记拉曼光谱与单细胞分辨率的AI结合使用，识别出两种不同的精子光谱亚型。这些亚型与胚胎学结果显著相关，包括双核受精率、高质量胚胎率和囊胚形成率。通过使用基于GRU的序列模型，我们实现了高精度的预测
资助声明
本工作得到了国家自然科学基金（82303283（W.Z.）、广东省基础与应用基础研究基金（2023A1515220018（W.Z.）、2024A1515010652（W.Z.）、广州市科技计划项目（2025A03J4199（W.Z.）的资助
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
