《Synthetic and Systems Biotechnology》：Engineering
Escherichia coli for robust Co-utilization of glucose and xylose enables high-titer succinate production from lignocellulosic hydrolysates
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本研究针对木质纤维素水解液中葡萄糖与木糖共利用效率低、制约琥珀酸生物制造的瓶颈问题，通过系统代谢工程改造大肠杆菌C600，包括敲除副产物途径、缓解碳分解代谢阻遏（CCR）、引入外源木糖氧化途径（Weimberg和Dahms途径）及筛选全局转录调控因子突变体，成功构建了能高效共利用混合糖且仅需无机氮源的工程菌株ESC6crp-W68+。5-L发酵罐规模实验证实，该菌株能以1.15 mol/mol的产率从合成混合糖产87.7 g/L琥珀酸，并以1.02 mol/mol的产率直接从玉米秸秆水解液产77.3 g/L琥珀酸，为木质纤维素生物精炼提供了高效、低成本的细胞工厂平台。
琥珀酸作为一种重要的生物基平台化学品，在食品、医药和可生物降解聚合物（如聚丁二酸丁二醇酯）等领域具有广泛应用前景。随着全球碳中和政策的推进和一次性塑料的限制，其市场需求急剧增长。虽然微生物发酵法生产琥珀酸已在全球范围内实现商业化示范，但目前的生产仍主要依赖玉米葡萄糖或甘蔗蔗糖等粮食基原料，面临与粮争地、成本高昂且波动大等显著限制。因此，经济高效地利用木质纤维素水解液成为提升琥珀酸生物制造经济竞争力的关键途径。
木质纤维素水解液中的主要糖分是葡萄糖和木糖，其中木糖占比高达20%–40%。然而，大肠杆菌在同时利用葡萄糖和木糖时面临两大挑战：强烈的碳分解代谢阻遏（Carbon Catabolite Repression, CCR）和频繁的氧化还原代谢失衡，常导致生产速率和效价降低。尽管已有研究通过改造磷酸转移酶系统（PTS）或全局调控因子来缓解CCR，但这些全局修饰往往伴随显著的适应性代价，损害整体糖摄取速率，最终导致生长速率和生产力下降。此外，将木糖代谢与琥珀酸生物合成途径高效耦合，并维持细胞在复杂工业原料中的稳健性，仍是亟待解决的关键难题。
为解决上述问题，研究人员在《Synthetic and Systems Biotechnology》上发表论文，报道了他们如何对大肠杆菌C600（ATCC 23724）进行系统代谢工程，旨在增强其从混合糖及水解液生产琥珀酸的能力。研究首先利用C600菌株本身具有的低能耗木糖转运（通过XylE，一种主要协助超家族（MFS）转运蛋白）优势，其木糖代谢的ATP需求显著低于常用实验室菌株MG1655和BW25113（后者使用ATP依赖的ABC转运蛋白）。在此基础上，研究人员逐步敲除了竞争性副产物途径（包括编码乳酸脱氢酶的ldhA、编码丙酮酸甲酸裂解酶的pflB、编码乙醇脱氢酶的adhE以及乙酸磷酸转移酶途径的pta-ackA），以引导碳流向琥珀酸。同时，通过删除ptsG基因修饰PTS系统，缓解了CCR，使工程菌株ESC3能够同时利用葡萄糖和木糖。为缓解木糖代谢固有的高ATP需求，研究人员引入了来自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的pck基因（编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，PEPCK），以增强ATP再生。
为进一步提升木糖利用效率并克服天然异构酶途径的限制，研究团队引入了来自新月柄杆菌（Caulobacter crescentus）的异源木糖氧化途径——Weimberg途径和Dahms途径。Weimberg途径能将木糖通过五步反应转化为α-酮戊二酸，每分子木糖产生两分子NADH且无碳损失，有利于TCA循环衍生产物（如琥珀酸）的合成；而Dahms途径则将木糖裂解为丙酮酸和乙醇醛，代谢灵活性高但还原力产生较少且有碳损失。研究人员构建了核糖体结合位点（RBS）文库来精细调控这些途径关键基因的表达水平，以优化代谢通量。最终，通过筛选全局转录因子突变体文库，获得了一个含有crp基因同义突变（Crp_E130E）的菌株ESC6crp-W68+，该突变显著增强了菌株在仅含无机氮源的限定培养基中的生长和琥珀酸生产能力。
为开展研究，作者运用了以下关键技术方法：利用CRISPR/Cas9系统进行基因敲除和染色体整合，构建工程菌株；通过构建RBS文库并结合高通量筛选（如在48孔板中监测生长曲线），优化异源木糖氧化途径（Weimberg、Dahms途径）基因的表达水平；应用全局转录调控因子突变体文库并结合条形码扩增与下一代测序（NGS）分析，筛选在限定培养基（以无机氮为唯一氮源）中生长优良的突变体；采用两阶段发酵工艺（好氧生长 followed by 厌氧生产）进行摇瓶和5-L生物反应器规模的琥珀酸发酵评估；使用高效液相色谱（HPLC）分析代谢产物（琥珀酸、副产物）和糖浓度，并检测细胞内ATP、NADH/NAD+、cAMP水平；以市售玉米秸秆为原料，经过碱预处理和酶水解（使用Novozymes Cellic? CTec3 HS纤维素酶）制备木质纤维素水解液，并用于发酵验证。
3.1. 野生型大肠杆菌C600木糖代谢特性的表征
研究首先比较了不同大肠杆菌菌株（C600, MG1655, BW25113）的木糖转运系统和细胞内ATP水平。结果显示，C600采用低能耗的XylE转运蛋白，其在以木糖为唯一碳源生长时，细胞内ATP浓度（OD600=3时达2.59 nM）显著高于MG1655和BW25113，表明C600在木糖代谢中能维持更有利的能量状态。野生型C600在厌氧条件下以木糖为底物时，主要积累乳酸和甲酸，琥珀酸产量较低（3.13 g/L）。敲除ldhA和pflB基因得到菌株ESC2后，琥珀酸产量提升至8.31 g/L。进一步敲除ptsG基因（得到ESC3）缓解了CCR，实现了葡萄糖和木糖的共利用，并测得细胞内cAMP水平显著升高。引入pck基因（得到ESC4）后，木糖条件下的细胞生长（OD600）和混合糖条件下的生物量均得到增强。研究还发现，pck无法完全替代内源ppc基因（编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，PPC）的回补功能，因此后续实验保留了ppc。
3.2. 构建用于琥珀酸生物合成的工程大肠杆菌菌株
在ESC4基础上，逐步敲除adhE和pta-ackA（得到ESC5和ESC6），并采用两阶段发酵工艺。在以木糖为唯一碳源时，ESC6的琥珀酸产量和产率分别达到15.08 g/L和1.19 mol/mol。在葡萄糖-木糖混合糖发酵中，ESC6的琥珀酸产量高达19.66 g/L，产率达1.46 mol/mol，相比野生型C600（2.23 g/L, 0.21 mol/mol）有近七倍提升，表明能量供应增强和碳流重定向的成功。
3.3. 优化异源木糖利用途径以提高琥珀酸产量
在敲除内源木糖异构酶途径的ESC7菌株中，引入并优化了Weimberg和Dahms途径。初步实验表明，单独引入异源途径效果不佳。补充表达辅助基因（xylC和yjhG）后，菌株性能显著提升。将优化后的异源途径（特别是Weimberg途径）与内源XI途径在ESC6背景中共表达，并通过RBS文库筛选获得高性能菌株ESC6-W68+。该菌株在混合糖发酵中琥珀酸产量达16.2 g/L，产率1.18 mol/mol，显著优于仅含XI途径的ESC6（8.7 g/L, 0.86 mol/mol）。NADH/NAD+比率测定证实Weimberg途径菌株具有更高的还原力水平。测序分析显示，XylB_C.c基因的高表达与优良性能相关。不同RBS变体菌株表现出可调的葡萄糖-木糖消耗比例（2.5:1至5:1），且不影响琥珀酸产量，显示出对木质纤维素水解液不同糖组成的适应性。
3.4. 筛选全局调控因子突变体库及构建可利用无机氮源的突变菌株
以ESC6为底盘，构建并筛选了覆盖61个全局调控因子的突变体文库。在无酵母提取物（YE）的限定培养基中筛选到富含的突变体，包括crp基因的同义突变Crp_E130E。将该突变引入ESC6-W68+背景，得到ESC6crp-W68+。该突变体在无机氮源培养基中生长和琥珀酸生产能力显著增强，发酵120小时后琥珀酸产量达15.20 g/L，产率1.21 mol/mol，与在含YE的复杂培养基中性能相当。研究表明，crp基因上的三个同义突变（E130E, K131K, V132V）可能通过改变密码子使用偏好，影响了CRP蛋白的调控功能，从而增强了菌株在氮限制条件下的适应性。
3.5. 在5-L生物反应器中使用混合糖和玉米秸秆水解液进行放大发酵
在5-L生物反应器中，对优化菌株ESC6crp-W68+进行了补料分批发酵评估。使用合成混合糖（模拟水解液糖组成）时，菌株在144小时发酵后，消耗葡萄糖91.23 g/L和木糖20.76 g/L（比例4.4:1），琥珀酸产量达87.7 g/L，产率1.15 mol/mol。使用真实的玉米秸秆水解液（经碱预处理和酶水解制备，含葡萄糖145 g/L，木糖36.8 g木糖等）时，菌株同样表现出稳健的代謝謝，消耗葡萄糖89.06 g/L和木糖22.43 g/L（比例4.0:1），琥珀酸产量达77.3 g/L，产率1.02 mol/mol，厌氧阶段体积生产率为0.64 g/L/h。与近期报道的其他高产琥珀酸工艺相比，该研究构建的菌株平台避免了细胞浓缩、有机氮补充和外源氧化还原添加剂，在工艺简单性、可放大性和经济性方面具有优势。
研究结论与讨论
本研究通过多层次的代谢工程策略，成功构建了一株能够高效共利用木质纤维素水解液中葡萄糖和木糖生产琥珀酸的大肠杆菌工程菌。研究首先利用C600菌株天然的能效优势，并通过敲除副产物途径、改造PTS系统缓解CCR、引入pck增强ATP供应，奠定了高效琥珀酸合成的基础。进而，引入并优化异源木糖氧化途径（特别是Weimberg途径），通过RBS文库精细调控基因表达，解决了途径整合中的代谢冲突和通量平衡问题，显著提升了琥珀酸产率和还原力供应。最后，通过全局转录调控工程，获得了能够高效利用无机氮源的crp突变体，极大增强了菌株在低成本限定培养基中的适应性和生产稳定性。5-L规模发酵成功验证了该工程菌株直接利用真实木质纤维素水解液生产高性能琥珀酸的工业可行性。该研究不仅为琥珀酸的生物制造提供了一条经济、可持续的路径，其集成的代谢工程策略（包括途径优化、表达调控和全局适应性进化）也为改造微生物细胞工厂以高效利用非粮生物质提供了可借鉴的框架。值得注意的是，研究中发现的同义突变对菌株生理和代谢的显著影响，提示了在精细调控层面进行工程化（如密码子优化、mRNA结构设计）的潜在价值。总之，该工作展示了系统代谢工程在推动生物基化学品制造走向商业化应用中的强大潜力。
