利用马克斯克鲁维酵母高温发酵菊芋粉和粗甘油生产3-羟基丙酸

《Synthetic and Systems Biotechnology》：Engineering Kluyveromyces marxianus for 3-hydroxypropionic acid production at elevated temperature from Jerusalem artichoke tubers and crude glycerol

本研究针对化学法合成3-羟基丙酸（3-HP）依赖石化资源、污染严重的问题，报道了研究人员通过代谢工程改造耐热酵母马克斯克鲁维酵母，构建了以菊芋粉和粗甘油为原料、通过丙二酰辅酶A途径高效合成3-HP的细胞工厂。工程菌株YLJC06在42°C下通过补料分批发酵，可从菊芋粉合成32.31 g/L的3-HP；通过重构甘油代谢途径并优化辅因子供应，工程菌株YLJC15在42°C下可从粗甘油合成26.57 g/L的3-HP。该研究为利用非粮生物质和工业副产物绿色制造可降解塑料前体提供了新策略，其高温发酵过程可显著降低能耗与碳排放，具有重要的工业应用前景。

　　

在全球积极推动碳中和与绿色制造的背景下，开发以可再生生物质为原料、环境友好的化工产品生产工艺成为研究热点。3-羟基丙酸（3-HP）作为一种重要的平台化合物，是合成生物基可降解塑料聚（3-羟基丙酸）（P3HP）的关键前体，其市场需求日益增长。然而，传统的化学合成法依赖石油衍生原料，存在高能耗、高污染等问题。微生物发酵法虽具潜力，但常面临底盘细胞耐受性差、副产物多、过程控制严格以及常温发酵冷却水消耗大等挑战，制约了其工业化应用。因此，发掘具有独特优势的微生物底盘，如耐高温、底物范围广、生长迅速的菌株，并开发高效的发酵工艺，对于实现3-HP的经济绿色生产至关重要。

本研究发表于《Synthetic and Systems Biotechnology》，研究人员选择耐热酵母马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）作为底盘细胞，着眼于解决传统3-HP生产方法的瓶颈问题。该酵母具有生长速度快、耐受高温、能够利用多种碳源（包括菊芋中的菊粉和 biodiesel 副产物粗甘油）等突出优点。特别是其高温发酵特性（可达42°C甚至更高），能大幅减少工业生产中冷却水的用量，从而降低成本和环境足迹。研究旨在通过系统的代谢工程改造，构建能够高效利用廉价非粮生物质（菊芋粉）和工业废弃物（粗甘油）在高温度下生产3-HP的K. marxianus工程菌。

为开展本研究，作者运用了几个关键技术方法：利用瞬时CRISPR/Cas9基因编辑技术对K. marxianus进行基因敲除（如Adh2A, Ach1）和异源基因（如来自Chloroflexus aurantiacus的突变型丙二酰辅酶A还原酶基因CaMCR^{N940V/K1106W/S1114R}）整合；重构甘油代谢途径，将酵母天然的FADH₂依赖型GUT1/GUT2途径替换为NADH依赖型的GDH1/DAK1途径；通过摇瓶和生物反应器进行分批与补料分批发酵，评估工程菌株在不同温度（30, 37, 42, 45°C）和不同碳源（葡萄糖、果糖、菊粉、甘油、粗甘油、菊芋粉）下的3-HP合成性能；使用高效液相色谱（HPLC）检测代谢产物浓度，并测定细胞内辅因子（NADH, NADPH）和中间代谢物（如二羟丙酮DHA）水平。研究所用菊芋粉为市售产品，粗甘油来源于生物柴油生产副产物。

3.1. 在K. marxianus中构建用于3-HP合成的丙二酰辅酶A途径

研究人员首先在K. marxianus YZB402中，通过瞬时CRISPR/Cas9技术将密码子优化的突变型MCR^{N940V/K1106W/S1114R}表达盒整合到Lac4基因位点，获得工程菌YLJC01。该菌株成功实现了3-HP的合成，证明异源MCR在K. marxianus中具有活性。使用葡萄糖、果糖和菊粉为碳源时，YLJC01均能产3-HP，且利用菊粉时产量略高，副产物减少，推测与菊粉需先水解成单糖、代谢速率较慢有关。

3.2. 阻断副产物合成提高3-HP产量

为了减少碳流损失，研究人员敲除了负责乙醇合成的Adh2A基因（得YLJC03）和负责乙酸合成的Ach1基因（得YLJC04），以及双敲除获得YLJC06。结果表明，阻断副产物合成能有效提高3-HP产量，其中双敲除菌株YLJC06效果最佳，在以菊粉为碳源时，3-HP产量显著提升。

3.3. YLJC01在30°C、37°C和42°C下利用甘油合成3-HP

考察YLJC01以非发酵性碳源甘油为底物合成3-HP的能力。发现在甘油上3-HP产量远高于在葡萄糖等发酵性碳源上的产量，归因于甘油代谢速率较慢，有利于3-HP积累。同时，较高温度（42°C）下产量更高，伴随细胞内NADPH水平升高，提示辅因子供应可能是限速步骤。

3.4. 采用发酵工程策略提高YLJC06利用菊芋粉生产3-HP的能力

优化YLJC06利用菊芋粉的发酵条件。确定100 g/L菊芋粉为较适初始浓度。比较不同氧供应条件（密封、纱布包裹、带挡板的密封/纱布包裹摇瓶）和不同工业氮源（豆粕肽、鱼粉肽、玉米浆、豆粕提取物），发现加强供氧和使用鱼粉肽有利于3-HP合成。添加CaCO₃（35 g/L最优）既可作为pH缓冲剂，其解离的HCO₃^-又是乙酰辅酶A羧化酶（ACC1）催化生成丙二酰辅酶A的底物，进一步提高了3-HP产量。

3.5. 菌株YLJC06在生物反应器中利用菊芋粉合成3-HP

在5 L发酵罐中进行分批和补料分批发酵。在42°C下，YLJC06利用菊芋粉合成3-HP的产量（32.31 g/L）高于37°C（27.32 g/L），证明了高温发酵的优势。

3.6. 在K. marxianus中重构甘油代谢途径

为解决野生型K. marxianus通过GUT1/GUT2途径代谢甘油产生FADH₂、能量效率较低的问题，研究人员构建了甘油利用缺陷菌株（缺失gut1, gut2, gcy1），然后引入来自Ogataea parapolymorpha的NAD⁺依赖型甘油脱氢酶基因OpGdh1和K. marxianus自身的二羟丙酮激酶基因KmDak1，构建了NADH依赖型的GDH1/DAK1甘油代谢途径（得YLJC11）。此途径改造增强了菌株利用甘油的能力，并提高了细胞内NADH和NADPH的水平。

3.7. 甘油重构菌株的甘油代谢能力测定

生长曲线表明，成功重构GDH1/DAK1途径的菌株YLJC11恢复并增强了甘油利用能力。细胞内DHA含量测定证实Dak1的过表达有效降低了DHA积累，避免了其抑制效应。

3.8. 甘油重构菌株细胞内DHA含量的测定

3.9. 甘油重构菌株细胞内NADH和NADPH含量的测定

辅因子测定显示，重构GDH1/DAK1途径的菌株（如YLJC11, YLJC13）细胞内NADH和NADPH水平均显著高于野生型或途径缺陷型菌株，为3-HP合成提供了更充足的还原力。

3.10. 比较YLJC01、YLJC13、YLJC15和YLJC16利用甘油合成3-HP的能力

在引入MCR基因的基础上，比较不同工程菌的3-HP产量。重构了GDH1/DAK1途径的YLJC13产量高于基础菌YLJC01。进一步过表达Utr1（促进NADH向NADPH转化）得到YLJC15，其3-HP产量最高；而补充表达Gcy1的YLJC16产量反而下降，推测因Gcy1途径在好氧条件下非主要代谢途径且对甘油亲和力较低。

3.11. YLJC15在发酵罐中利用甘油进行分批和补料分批发酵

3.12. YLJC15在发酵罐中利用粗甘油进行补料分批发酵

在发酵罐中，YLJC15在37°C和42°C下均能高效利用纯甘油和粗甘油合成3-HP。补料分批发酵在42°C下能达到最高产量（33.15 g/L，纯甘油；26.57 g/L，粗甘油），再次凸显了高温发酵的优越性。

本研究成功构建了能够高效利用菊芋粉和粗甘油在高温（42°C）下生产3-HP的K. marxianus工程菌。通过引入高效的MCR突变体、阻断竞争性副产物途径、重构甘油代谢以增强辅因子供应以及优化发酵工艺（特别是高温和补料策略），显著提高了3-HP的产量。该研究的重要意义在于：首先，为3-HP的绿色生物制造提供了一条具有成本效益且易于工业放大的新工艺路线；其次，实现了对非粮作物菊芋和工业副产物粗甘油的高值化利用，符合循环经济理念；最关键的是，充分利用了K. marxianus的耐热特性，将发酵温度提升至42°C，经估算可使每千吨发酵罐年节约冷却水约15.5万吨，减少二氧化碳排放约27.1吨，具有显著的节能降耗和环保效益。这项工作为开发下一代可持续的生物精炼过程提供了强有力的技术支撑和菌种资源。