《Scientific Reports》：Soluble epoxide hydrolase inhibitory constituents from the Heartwood of Toxicodendron vernicifluum: isolation, kinetic characterization, molecular modeling, and quantitative analysis
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本研究针对合成sEH抑制剂存在的药代动力学局限性和潜在副作用，从传统抗炎药材漆树（Toxicodendron vernicifluum）心材中系统分离出11种多酚类化合物，并首次阐明其抑制sEH的动力学机制。研究发现sulfuretin（IC50= 8.8±0.3 μM）和fisetin（IC50= 9.6±0.8 μM）为竞争性抑制剂，而butein（IC50= 21.4±1.5 μM）呈现非竞争性抑制。通过分子对接和100 ns分子动力学模拟揭示了二者分别结合催化中心与变构位点的分子机制，为开发新型抗炎药物提供了双重作用机制的天然先导化合物。
炎症调控和血管张力维持密切依赖于多不饱和脂肪酸的代谢过程。在这一复杂生理过程中，可溶性环氧化物水解酶（Soluble Epoxide Hydrolase, sEH）扮演着关键角色，它能够水解具有抗炎和血管舒张活性的环氧脂肪酸（Epoxy Fatty Acids, EpFAs），如环氧二十碳三烯酸（EETs）和环氧二十二碳五烯酸（EDPs），将其转化为活性较低的二醇产物。由于EpFAs具有强大的抗炎特性，sEH的过度活化会加速这些内源性保护性物质的分解，从而削弱机体的自然防御反应。因此，sEH已成为治疗心血管、神经和肾脏等炎症相关疾病的重要靶点。
尽管合成sEH抑制剂（如EC5026）已在临床试验中展现出潜力，但其药代动力学缺陷和潜在不良反应限制了临床应用。这一困境促使研究人员将目光转向天然产物宝库，期望从中发现结构新颖、安全性更高的抑制剂先导化合物。漆树（Toxicodendron vernicifluum）作为东亚地区传统药材，其心材在民间长期用于治疗炎症性疾病，但其作用于sEH的确切机制尚未明确。
为解决上述问题，研究人员对漆树心材乙醇提取物进行了系统研究。通过活性导向分离技术，发现乙酸乙酯萃取部位具有最强的sEH抑制活性（50 μg/mL浓度下抑制率达57.6%）。进一步分离纯化获得11个已知多酚类化合物，包括二氢黄酮醇、黄酮醇、橙酮和查尔酮等不同亚型。酶动力学研究首次揭示：橙酮类化合物sulfuretin和黄酮醇fisetin为强效竞争性抑制剂，而查尔酮butein则通过非竞争性机制发挥作用。
为阐明抑制机理，研究团队采用分子对接技术模拟化合物与sEH的相互作用。结果显示sulfuretin和fisetin稳定结合于催化中心，与Asp335、Tyr383等关键残基形成氢键网络；而butein则占据催化中心外的变构位点。通过100 ns分子动力学模拟验证，sulfuretin在催化口袋内保持更稳定的氢键相互作用（4-6个持续性氢键），这为其更高抑制活性提供了结构基础。
通过建立优化的UPLC-DAD分析方法，研究人员定量分析了心材提取物中6种主要活性成分的含量。有趣的是，含量最丰富的fustin（262.10 mg/g）抑制活性较弱，而高效抑制剂sulfuretin（23.47 mg/g）、fisetin（14.20 mg/g）和butein（5.93 mg/g）虽为微量成分，却主导了提取物的整体抑制活性。这种"量-效"分离现象提示，漆树心材的药理功效主要取决于高活性微量成分而非大量成分。
在细胞水平验证中，这些化合物能显著抑制LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞一氧化氮（NO）产生，证实其体外抑制活性可转化为细胞抗炎效应。值得注意的是，sulfuretin、fisetin和butein此前已被报道可调控NF-κB和MAPK等炎症通路，表明漆树心材成分可能通过多靶点机制协同发挥抗炎作用，这为开发具有多靶点优势的抗炎药物提供了新思路。
本研究综合运用UPLC定量分析、酶动力学测定和计算化学模拟等关键技术方法。通过活性导向分离从植物材料中系统筛选活性成分；采用Lineweaver-Burk和Dixon绘图分析酶抑制动力学；利用分子对接和100 ns分子动力学模拟揭示分子结合机制；建立验证的UPLC-DAD方法进行成分定量分析。
sEH抑制活性测定：通过荧光检测法测定化合物对sEH的抑制率，计算IC50值和抑制常数（Ki），并利用Lineweaver-Burk和Dixon绘图判定抑制类型。
分子对接与动力学模拟：采用AutoDock进行分子对接，使用GROMACS 4.6.5软件包进行100 ns分子动力学模拟，分析蛋白-配体复合物的稳定性和相互作用细节。
UPLC定量分析：优化色谱条件，建立并验证UPLC-DAD方法，对提取物中6种主要成分进行同时定量，评估方法线性、精密度和准确度。
研究结果
生物活性导向分离与化合物鉴定：通过系统分离鉴定出11种多酚类化合物，包括fustin（1）、ethyl gallate（2）、taxifolin（3）、garbanzol（4）、fisetin（5）、butin（6）、sulfuretin（7）、eriodictyol（8）、butein（9）、gallic acid（10）和fisetinidol-4a-ol（11）。乙酸乙酯部位显示最强抑制活性，确定为活性部位进行深入研究。
sEH抑制活性与动力学特征：sulfuretin（7）和fisetin（5）显示最强竞争性抑制活性，IC50值分别为8.8±0.3 μM和9.6±0.8 μM。butein（9）为非竞争性抑制剂，IC50为21.4±1.5 μM。其他化合物活性中等或较弱，表明抑制活性的结构特异性。
分子对接揭示结合模式：sulfuretin和fisetin结合于sEH催化中心，与Asp335、Tyr383等关键残基形成氢键；butein结合于变构位点，与Phe267、Phe497等残基相互作用，从结构上解释了其非竞争性抑制机制。
分子动力学验证结合稳定性：100 ns模拟显示sulfuretin在催化中心形成更稳定的氢键网络（4-6个持续性氢键），而fisetin的氢键数量较少（1-3个），这为sulfuretin更高抑制活性提供了分子基础。
UPLC定量分析：建立并验证的UPLC方法成功用于提取物中6种成分的定量分析。fustin含量最高（262.10 mg/g），但活性成分sulfuretin（23.47 mg/g）、fisetin（14.20 mg/g）和butein（5.93 mg/g）虽含量较低，却是主要活性贡献者。
研究结论与意义
本研究首次系统阐明了漆树心材作为sEH抑制剂的天然来源，发现其中含有作用机制互补的竞争性和非竞争性抑制剂。sulfuretin和fisetin通过直接竞争催化中心发挥抑制活性，而butein通过变构调节机制作用，这种双重抑制机制可能产生协同治疗效果。
研究通过整合化学计量学与酶动力学分析，揭示了植物药效的物质基础规律：高活性微量成分而非大量成分主导整体药理活性。这一发现对天然药物研发具有重要启示意义。
漆树心材中多种黄酮类成分不仅具有sEH抑制活性，此前研究还表明其可调控NF-κB和MAPK等多条炎症通路，这种多靶点特性可能使其相对于单一靶点抑制剂具有更好的治疗潜力和安全性。
该研究为漆树传统抗炎用途提供了科学依据，为开发新型sEH靶向抗炎药物提供了天然先导化合物。未来需进一步开展体内药效学、药代动力学和安全性评价，推动这些天然抑制剂向临床应用转化。
