《Scientific Reports》：Cholangiocarcinoma derived exosomes attenuate the anti-tumor functions of NK cells
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本研究针对胆管癌免疫逃逸机制不清的难题，揭示了肿瘤来源外泌体通过诱导NK细胞凋亡、抑制其细胞因子分泌及细胞毒性、并下调关键黏附分子表达，从而削弱机体抗肿瘤免疫监视作用，为胆管癌的免疫治疗提供了新的潜在靶点。
在肝脏恶性肿瘤的家族中，胆管癌（Cholangiocarcinoma, CCA）以其隐匿性强、预后极差而令人闻之色变，尤其是其发病率在全球范围内呈上升趋势，更敲响了公共卫生的警钟。尽管手术、化疗等手段不断进步，但胆管癌患者，特别是肝内胆管癌（iCCA）患者，五年生存率依然低迷。这背后，肿瘤细胞如何巧妙地“伪装”自己，逃避免疫系统的“追捕”，即免疫逃逸，是一个核心的未解之谜。在人体免疫大军中，自然杀伤细胞（Natural Killer cells, NK cells）如同天生的“杀手”，无需预先训练就能识别并清除癌变细胞，是抗肿瘤免疫的第一道防线。然而，在胆管癌的肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中，这些本应骁勇善战的NK细胞却常常显得“力不从心”，其数量和功能均显著下降。究竟是什么“黑手”在暗中削弱NK细胞的战斗力？近年来，外泌体（exosomes）——这种由细胞释放的纳米级囊泡，作为细胞间通讯的“信使”，在肿瘤进展中的作用日益受到关注。肿瘤细胞衍生的外泌体（Tumor-derived exosomes, TEX）被发现能够向免疫细胞传递抑制信号，从而帮助肿瘤实现免疫逃逸。那么，胆管癌是否也利用了外泌体这一“特洛伊木马”来压制NK细胞的功能？这一问题吸引了滨州医学院附属医院白学礼研究员团队的目光，他们的研究成果《胆管癌来源外泌体减弱NK细胞的抗肿瘤功能》于2026年1月正式发表在《Scientific Reports》期刊上，为我们揭开了谜底。
为了深入探究胆管癌外泌体（CCA-Exos）与NK细胞的相互作用，研究人员运用了几项关键的技术方法。他们从人源胆管癌细胞系（RBE细胞）、胆管癌患者血清和健康人血清中分离纯化外泌体，并通过透射电镜、纳米颗粒追踪分析和Western blot对其进行了鉴定。研究团队利用人NK细胞系（NK-92细胞）以及从胆管癌患者和健康人外周血分离的原代NK细胞作为研究对象。通过流式细胞术、CCK-8法、酶联免疫吸附试验（ELISA）、乳酸脱氢酶（LDH）释放实验、定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）和Western blot等技术，系统评估了外泌体对NK细胞凋亡、增殖、细胞因子分泌、杀伤活性以及关键分子表达的影响。此外，还通过免疫组化分析了胆管癌组织与癌旁组织中NK细胞的浸润情况。
临床特征及NK细胞在胆管癌和癌旁组织中的浸润
研究伊始，团队通过对20例胆管癌患者组织样本的免疫组化分析发现，与癌旁组织相比，胆管癌组织内表达CD56和NKp46（NK细胞相对特异性标志物）的NK细胞数量明显减少，这表明NK细胞在胆管癌病灶中的浸润受到了抑制。然而，这种NK细胞浸润的减少与患者的性别、年龄、淋巴结转移、浸润深度、肿瘤部位和分化程度等临床病理特征均无显著相关性。这提示，胆管癌可能存在着某种不依赖于传统病理特征的、更为普适的抑制NK细胞浸润的机制。
分离的外泌体表征
成功的机制探索始于对研究工具的精准把控。研究人员从RBE细胞培养上清、胆管癌患者血清和健康人血清中分离出的囊泡，在透射电镜下呈现出典型的杯状形态，粒径约80-100纳米，并且高表达外泌体标志蛋白HSP70和CD63，纳米颗粒追踪分析（NTA）也确认了其粒径分布和浓度。这些特征均证实成功获得了高纯度的外泌体。进一步的示踪实验显示，用DiO绿色荧光染料标记的胆管癌来源外泌体能够被NK-92细胞有效内化，为后续的功能研究奠定了基础。
外泌体在体外促进NK-92细胞凋亡
功能研究的首个重要发现是胆管癌外泌体对NK细胞生存的直接威胁。流式细胞术检测结果显示，无论是RBE细胞来源的外泌体（RBE-Exos）还是胆管癌患者血清来源的外泌体（CCA血清-Exos），在处理NK-92细胞48小时后，均能显著诱导细胞凋亡。值得注意的是，RBE-Exos能同时诱导早期和晚期凋亡，而CCA血清-Exos主要诱导晚期凋亡。为了阐明其分子机制，研究人员检测了凋亡相关基因的表达。qRT-PCR和Western blot结果一致表明，RBE-Exos处理能显著下调NK-92细胞中抗凋亡蛋白BCL-2和BCL-XL的mRNA和蛋白水平，而对促凋亡蛋白BAX和BAD的表达无显著影响。这表明胆管癌外泌体可能是通过打破细胞内的凋亡平衡，特异性削弱NK细胞的“求生意志”，从而促使其走向死亡。
胆管癌外泌体对NK-92细胞增殖无影响
有趣的是，与外泌体在其他肿瘤中对免疫细胞增殖的抑制效应不同，本研究通过CCK-8实验发现，RBE-Exos和CCA血清-Exos处理并未对NK-92细胞的增殖能力产生明显影响。这说明胆管癌外泌体对NK细胞的抑制作用并非通过限制其“扩军”，而是直接削弱现有“部队”的战斗力。
RBE-Exos减少NK-92细胞效应分子的分泌
NK细胞杀伤肿瘤细胞依赖于其释放的多种效应分子。ELISA检测发现，经RBE-Exos处理的NK-92细胞，其培养上清中关键细胞因子IFN-γ（干扰素-γ）和毒性颗粒granzyme B（颗粒酶B）的分泌量显著降低，而TNF-α（肿瘤坏死因子-α）和perforin（穿孔素）的水平则无显著变化。IFN-γ和granzyme B是NK细胞杀伤活性的核心执行者，它们的减少直接预示着NK细胞功能的受损。
外泌体减弱NK-92细胞的杀伤活性
最直接的证据来自细胞毒性实验。LDH释放实验表明，经RBE-Exos或CCA血清-Exos预处理后的NK-92细胞，对其经典靶细胞K562的杀伤能力在不同效靶比（E:T ratio）下均明显低于对照组。更重要的是，从胆管癌患者外周血分离的原代NK细胞，其杀伤活性也显著低于健康对照者的原代NK细胞。这有力地证明，胆管癌外泌体在体内外均能实质性削弱NK细胞的直接抗癌能力。
外泌体下调NK-92细胞黏附分子的表达
研究人员还观察到一个有趣的现象：经RBE-Exos处理的NK-92细胞失去了正常的集落生长特性，变得分散。这提示细胞间黏附可能受损。进一步的分子检测发现，RBE-Exos能显著下调NK-92细胞中黏附分子CD11a、CD18和CD54的mRNA和蛋白水平，而对CD2的表达无影响。CD11a和CD18共同组成淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1），其配体是细胞间黏附分子-1（ICAM-1，即CD54）。LFA-1/ICAM-1通路不仅对免疫细胞间黏附、聚集至关重要，也参与NK细胞与靶细胞的结合及其活化信号的传导。同样，胆管癌患者来源的原代NK细胞表面CD18和CD54的表达水平也显著低于健康对照。这表明，胆管癌外泌体通过下调这些关键黏附分子，可能阻碍了NK细胞在肿瘤部位的募集、细胞间的相互作用以及其与肿瘤细胞的有效接触，从而间接抑制其功能。这也为解释为何胆管癌组织中NK细胞浸润减少提供了潜在机制。
结论与展望
本研究系统而深入地揭示了胆管癌逃逸NK细胞免疫监视的一条新途径：胆管癌细胞通过释放外泌体，被NK细胞摄取后，一方面通过下调抗凋亡蛋白BCL-2和BCL-XL诱导NK细胞凋亡，并抑制其产生IFN-γ和granzyme B等关键效应分子，直接削弱其杀伤能力；另一方面，通过下调黏附分子CD11a、CD18和CD54的表达，破坏NK细胞的正常聚集及其与靶细胞的相互作用，间接影响其功能。这种多管齐下的抑制作用，最终帮助胆管癌成功实现免疫逃逸。
该研究不仅深化了我们对胆管癌免疫抑制微环境形成的认识，更重要的是，它将外泌体这一新型细胞间通讯载体确立为胆管癌免疫治疗的一个潜在新靶点。未来，针对胆管癌来源外泌体及其所携带的特定抑制性分子的干预策略，例如开发中和抗体或小分子抑制剂，有望与现有的免疫检查点抑制剂等疗法联合应用，为逆转胆管癌的免疫抑制状态、提高免疫治疗效果开辟新的道路。当然，外泌体携带的具体抑制性成分（如特定的miRNA、蛋白质等）及其精确的作用机制，仍是未来需要深入探索的方向。
