《Scientific Reports》：Prognostic role of CDCA3 in lung adenocarcinoma with immune infiltration
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本文聚焦肺腺癌治疗耐药难题，研究人员通过多组学数据分析结合实验验证，系统探讨了细胞分裂周期相关蛋白3（CDCA3）的预后价值。研究发现CDCA3在肺腺癌中显著高表达且与不良预后相关，其表达水平影响免疫细胞浸润格局并调控肿瘤细胞凋亡。该研究为肺腺癌免疫治疗分层提供了新型生物标志物，具有重要临床转化意义。
肺癌，尤其是肺腺癌（LUAD），是全球癌症相关死亡的主要原因之一。当前的治疗手段，如铂类化疗，往往面临耐药的严峻挑战。尽管免疫检查点抑制剂等新兴疗法为晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者带来了希望，但肺癌患者的5年生存率仍然低于20%，发生转移后则更低。因此，深入探究肺癌的发病机制，寻找具有高特异性和敏感性的新型生物标志物及治疗靶点，已成为改善患者预后的迫切需求。
在这一背景下，细胞分裂周期相关蛋白3（CDCA3）进入了研究人员的视野。CDCA3是SCF（SKP1-Cullin-RING-F-box）泛素连接酶复合体的一个组分，能够靶向降解细胞周期G2期检查点激酶WEE1，从而调控细胞周期进程。细胞周期失调与细胞不受控的增殖密切相关，进而促进恶性肿瘤的发生发展。已有研究表明，CDCA3在肝细胞癌、口腔鳞状细胞癌、前列腺癌、胃癌和膀胱癌等多种癌症中表达上调，且其高表达与患者不良预后强烈相关。然而，CDCA3在肺腺癌中的全面研究仍较为有限，其表达模式、预后价值以及与肿瘤免疫微环境的相互作用尚不明确。
为了填补这一空白，陈艳丽、徐欣瑶等研究人员在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们开展了一项综合性研究，旨在系统评估CDCA3在肺腺癌中的表达、预后意义及其与免疫细胞浸润和免疫治疗反应的关联。
研究人员为开展此项研究，综合运用了多种关键技术方法。他们从TCGA（The Cancer Genome Atlas）和GEO（Gene Expression Omnibus）数据库获取了肺腺癌的mRNA表达谱和临床数据，并利用GSE207422单细胞RNA测序数据集进行深入分析。通过生物信息学方法，他们进行了差异表达分析、生存分析（Kaplan-Meier）、基因富集分析（GO和KEGG）、肿瘤微环境评估（ESTIMATE和CIBERSORT算法）、免疫检查点表达相关性分析以及药物敏感性预测（oncoPredict R包）。此外，研究还通过体外实验进行验证，使用A549肺腺癌细胞系，通过siRNA转染敲低CDCA3表达，并利用蛋白质印迹法（Western Blot）、定量实时PCR（qRT-PCR）和流式细胞术检测CDCA3敲低对细胞凋亡的影响。
3.1 CDCA3在肺癌及其他癌症中的表达水平
研究人员首先在泛癌水平分析了CDCA3的表达。结果显示，与正常组织相比，CDCA3在包括肺腺癌（LUAD）在内的17种癌症的肿瘤组织中表达显著上调。在TCGA肺腺癌队列中，CDCA3在541个肿瘤样本中的表达显著高于59个癌旁正常组织，这一结果在58对配对的肿瘤-正常样本比较中也得到确认。此外，在GEO数据集（GSE43458和GSE32863）的验证中，CDCA3在肿瘤组织中的高表达趋势同样明显。生存分析进一步揭示，无论是在TCGA数据库还是GEO数据集（GSE31210）中，CDCA3高表达的肺腺癌患者其总生存期（OS）均显著短于低表达患者，表明CDCA3高表达是肺腺癌的不良预后因素。蛋白质印迹实验也证实，肺腺癌肿瘤组织中的CDCA3蛋白水平高于癌旁正常组织。
3.2 CDCA3表达与LUAD患者临床特征及生物标志基因的关联
研究还探讨了CDCA3表达与临床病理特征的关系。分析发现，CDCA3的高表达与患者的年龄、性别、T分期（肿瘤原发灶浸润深度）、N分期（区域淋巴结转移）和临床分期（Stage）显著相关，但与M分期（远处转移）无显著相关性。此外，CDCA3的表达与多个已知的肺腺癌生物标志基因（如TROAP、FOXM1、AURKB、CENPA）的表达呈显著正相关，提示CDCA3可能参与肺腺癌的发生发展过程，并与这些基因存在潜在协同作用。
3.3 差异表达基因的鉴定及功能分析
为了深入探究CDCA3的功能，研究人员根据CDCA3表达中位数将TCGA样本分为高、低表达两组，并鉴定出100个差异表达基因（DEGs），其中上调和下调基因各50个。基因本体（GO）富集分析显示，这些差异基因显著富集于核分裂、染色体区域、微管马达活性等生物学过程和细胞组分/分子功能。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析表明，差异基因主要富集在细胞周期、补体和凝血级联、DNA复制、范可尼贫血通路、ECM-受体相互作用等关键通路，这提示CDCA3可能通过调控细胞周期进程和细胞外基质相互作用等机制影响肺腺癌的进展。
3.4 CDCA3表达与免疫的关系
肿瘤微环境（TME）分析是本研究的一大重点。利用ESTIMATE算法计算肿瘤微环境评分发现，CDCA3高表达组的基质评分（StromalScore）、免疫评分（ImmuneScore）和综合评估分（EstimateScore）均较低，表明该组肿瘤的基质和免疫细胞浸润较少，肿瘤纯度较高。进一步使用CIBERSORT算法估算22种免疫细胞亚型的浸润比例，结果显示有14种免疫细胞与CDCA3表达显著相关。其中，CD8+T细胞、活化记忆CD4+T细胞、滤泡辅助性T细胞（Tfh）、调节性T细胞（Treg）、静息NK细胞、M0和M1型巨噬细胞等的比例与CDCA3表达呈正相关。在GEO数据集中的验证分析也再次确认了活化记忆CD4+T细胞和M0巨噬细胞与CDCA3的正相关关系。
3.5 CDCA3表达与免疫异质性的单细胞转录组分析
为了在更高分辨率下验证上述发现，研究人员对包含8个肺腺癌样本的单细胞转录组数据（GSE207422）进行了分析。通过UMAP降维和细胞注释，共识别出11种主要细胞类型，并利用CopyKAT算法区分了恶性上皮细胞和良性上皮细胞。根据CDCA3平均表达水平将样本分为高、低表达组后，发现两组间在T细胞和髓系细胞的占比上存在明显差异。对T细胞的亚群分析显示，CD8+耗竭T细胞和CD8+细胞毒性T细胞的比例在CDCA3高、低表达组间差异最大。对髓系细胞的亚群分析则发现，M1和M2型巨噬细胞的比例差异显著。细胞间通讯分析（CellChat）进一步揭示，在CDCA3高表达组中，癌细胞与CD8+细胞毒性T细胞、CD8+耗竭T细胞以及M1/M2巨噬细胞之间的相互作用增强，同时CD8+耗竭T细胞的自身通讯也增加。具体而言，CDCA3高表达的癌细胞通过SCGB3A2-MARCO、PPIA-BSG、MT-RNR2-FPRL2、MDK-SDC1/2/4和MDK-NCL等配体-受体对向M1/M2巨噬细胞发出的信号显著加强，这可能促进了巨噬细胞的招募、存活及其向免疫抑制表型的极化，从而支持肿瘤进展。
3.6 免疫检查点基因表达及免疫治疗反应预测
免疫检查点抑制剂（ICIs）的应用改变了癌症治疗格局。本研究分析了CDCA3表达与21个免疫检查点基因的相关性，结果显示CDCA3与大多数免疫检查点（如CD40LG、CD27、TNFSF15、CD28、CD200R1等）的表达呈负相关。利用肿瘤免疫功能障碍和排斥（TIDE）算法和免疫表型评分（IPS）预测免疫治疗反应发现，在抗CTLA-4治疗且抗PD-1阴性（CTLA4_pos_PD1_neg）以及抗PD-1治疗且抗CTLA-4阴性（CTLA4_neg_PD1_pos）的情况下，CDCA3低表达组的IPS评分显著高于高表达组，提示CDCA3低表达可能预示着对CTLA-4和PD-1抑制剂更好的治疗反应。
3.7 针对CDCA3表达亚组的潜在治疗药物鉴定
药物敏感性分析旨在探索不同CDCA3表达水平患者对化疗或靶向药物的潜在反应差异。通过“oncoPredict” R包对TCGA队列样本进行药物IC50值预测，结果显示CDCA3高表达亚组对多种药物（如5-氟尿嘧啶、达拉非尼、吉非替尼、奥拉帕利等）表现出更低的IC50值，即更高的敏感性。这表明CDCA3高表达的患者可能更适合针对特定基因突变或癌症类型的靶向治疗，CDCA3或可作为用药指导的参考指标。
3.8 CDCA3敲低对LUAD细胞增殖和凋亡的影响
最后，研究通过体外实验验证CDCA3的功能。在A549肺腺癌细胞系中，利用siRNA成功敲低了CDCA3的表达（通过qRT-PCR和Western Blot验证）。流式细胞术检测细胞凋亡的结果显示，与对照组相比，CDCA3敲低显著增加了A549细胞的凋亡率。这一结果直接证明了CDCA3在维持肺腺癌细胞存活中的重要作用，抑制CDCA3可促进肿瘤细胞凋亡。
综上所述，本研究通过多层次的分析和实验验证，确立了CDCA3作为肺腺癌中的一个重要致癌基因。其高表达与患者不良预后、特定的免疫微环境特征（如活化的CD4+记忆T细胞和巨噬浸润改变）以及对免疫检查点抑制剂可能较差的反应相关。单细胞转录组分析进一步揭示了CDCA3高表达背景下，癌细胞与特定免疫细胞亚群（特别是CD8+T细胞和巨噬细胞）之间异常通讯的潜在机制。药物敏感性分析则为CDCA3高表达患者的个体化治疗提供了线索。体外实验证实靶向CDCA3可诱导肺腺癌细胞凋亡，强化了其作为治疗靶点的潜力。
研究的讨论部分指出，尽管近年来肺癌治疗取得进展，但肺腺癌的预后仍需改善。CDCA3作为一个关键的细胞周期调控因子，其表达上调和功能与p53信号通路等多个致癌通路相关联。本研究首次在肺腺癌中系统地将CDCA3与肿瘤免疫微环境，特别是T细胞和巨噬细胞的浸润状态和功能联系起来，并利用单细胞测序技术揭示了细胞间相互作用的细节。CDCA3表达与免疫检查点基因的负相关以及IPS评分的差异，提示CDCA3可能参与肿瘤免疫逃逸，并可能作为预测免疫治疗疗效的生物标志物。然而，研究也存在一些局限性，例如主要基于回顾性数据库分析，体外实验仅在单一细胞系中进行，未来需要更多机制性研究和独立队列验证。尽管存在这些限制，本研究的结果强烈支持CDCA3作为肺腺癌一个有前景的预后和免疫生物学标志物，具有潜在的转化应用价值。最终，本研究得出结论：CDCA3因其与肺腺癌预后和免疫细胞浸润的强关联，显示出作为预后生物标志物的潜力，并可能显著指导免疫治疗策略和药物选择。
