《Scientific Reports》：Identification of a novel real-time PCR reference gene panel for EA.hy926 endothelial cells in different growth States and with DHA treatment
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本研究针对EA.hy926内皮细胞在不同生长状态（增殖态/静息态）及DHA处理下缺乏稳定内参基因的问题，通过转录组数据筛选联合多算法验证，首次发现CAPZB与FBXO7为最优内参组合。该面板显著提升内皮标志物表达检测灵敏度，为血管生物学研究提供精准标准化工具，填补领域空白。
内皮细胞是血管壁的守护者，其功能失调与动脉粥样硬化、糖尿病等多种疾病密切相关。EA.hy926细胞系作为人类大血管内皮模型，可模拟体内功能紊乱和静息状态，是研究血管病理的重要工具。然而，实时定量PCR（RT-qPCR）作为基因表达分析的“金标准”，其准确性高度依赖稳定的内参基因（又称看家基因）。传统内参基因如ACTB（β-肌动蛋白）或RNA18S（18S核糖体RNA）在不同细胞状态或处理下可能出现表达波动，导致结论偏差。尤其当细胞接触DHA（二十二碳六烯酸）——一种具有心血管保护作用的Omega-3脂肪酸时，基因表达模式更易受干扰。目前，尚无针对EA.hy926细胞在生长状态转换及DHA干预下的内参基因系统验证，这严重限制了相关研究的可靠性。
为解决这一瓶颈，由Shiqi Huang、Samritha Raman Sivakumar、Jordan Charney等组成的研究团队在《Scientific Reports》发表论文，通过整合RNA测序（RNA-seq）与多算法评估，首次筛选出适用于EA.hy926细胞的内参基因组合。研究团队从RNA-seq数据中初筛18个候选基因，结合8个常用内参基因和1个数据库基因，共27个候选基因纳入评估。利用deltaCt、BestKeeper、geNorm、NormFinder和RefFinder五种算法综合分析表达稳定性，并通过内皮功能标志物（如CD36、NOS3）验证内参基因的实用性。
关键技术方法包括：基于RNA-seq的候选基因筛选（通过系数变异和DESeq2离散度评估）、RT-qPCR引物特异性与效率验证、五种稳定性算法交叉验证、以及多内参基因组合标准化效果比较。细胞实验采用EA.hy926细胞（ATCC CRL-2922），在铺被/未铺被基质胶（Matrigel）条件下培养至第4天（增殖态）或第10天（静息态），并分别用20μM或125μM DHA处理8小时。
候选内参基因的筛选与稳定性分析
从RNA-seq数据中筛选出的候选基因（如CAPZB、FBXO7）在表达变异系数（CV）和离散度上普遍低于常用内参基因（如ACTB、HPRT1）。RT-qPCR结果显示，CAPZB和FBXO7在不同生长状态下表达稳定，而RNA18S和ACTB的Cq值（定量周期）波动显著。RefFinder综合排名表明，CAPZB、SMU1和FBXO7为前三名最稳定基因，但SMU1因引物效率未达最优被排除。进一步通过geNorm的配对变异值（V2/3=0.0033）确认双内参基因（CAPZB+FBXO7）已足够满足标准化需求。
不同内参组合对标志物基因表达分析的影响
以内皮功能相关基因（CD36、CDH5、PCNA等）为指标，比较稳定内参组合（sHKGs：CAPZB+FBXO7）与常用内参组合（cHKGs：RNA18S+ACTB+HPRT1）的标准化效果。研究发现，sHKGs能更灵敏地检测生长状态引起的表达差异：例如，CD36在D10+MG（第10天铺胶静息态）相较于D4+MG（第4天铺胶增殖态）的表达倍数变化，使用CAPZB时为3.92倍，而使用RNA18S时高达6.97倍，表明后者可能夸大生物学差异。在DHA处理验证中，sHKGs对多数基因（如BTG1、PCNA）能有效捕捉DHA浓度效应，但在125μM DHA处理下，加入RNA18S可改善极端条件下的信号检测（如NOS3下调）。
讨论与意义
本研究突破性地将RNA-seq挖掘与非经典内参基因验证相结合，克服了传统内参在动态生物过程中的局限性。CAPZB（肌动蛋白封端蛋白）和FBXO7（E3泛素连接酶适配体）虽参与细胞骨架调控和炎症反应，但其基因表达在EA.hy926特定条件下保持稳定，凸显背景依赖性验证的重要性。结论强调，CAPZB+FBXO7组合为EA.hy926细胞在不同生长状态及DHA干预下的RT-qPCR分析提供最优标准化方案，且方法学可推广至其他细胞类型。未来研究需注意：在高浓度DHA（125μM）等应激条件下，可补充RNA18S以提升准确性。该成果严格遵循MIQE指南，为血管生物学基因表达研究树立新标准。
