《Nature Communications》：Functional and structural insights into interactions between β-Arrestin 1 and Gαs or Gαi1
编辑推荐：
本研究针对G蛋白与β-抑制蛋白(β-arrestin)直接相互作用的分子机制不明确这一关键问题，通过微量热泳动(MST)、氢氘交换质谱(HDX-MS)和β-链XX(βXX)释放测定等技术，揭示了β-抑制蛋白1(βarr1)与Gαs/Gαi1的构象特异性相互作用模式。研究发现βarr1的活性构象集合状态更易与Gα结合，且Gαs能特异性促进βarr1的C端释放，为理解GPCR信号转导的精细调控提供了新视角。
在细胞信号转导的复杂网络中，G蛋白偶联受体(GPCR)如同细胞的"信号接收天线"，能够感知外界刺激并启动下游信号通路。而G蛋白和β-抑制蛋白(β-arrestin)作为GPCR信号转导的两个主要"信号传递手"，长期以来被认为分别介导不同的信号通路。然而，近年来的研究发现这两个信号分子之间可能存在直接对话，这为理解GPCR信号转导的复杂性打开了新的窗口。
传统观点认为，GPCR激活后首先与G蛋白相互作用，引发GDP/GTP交换，导致Gα亚基与Gβγ二聚体分离，分别激活下游效应器。与此同时，激活的GPCR会被GPCR激酶(GRK)磷酸化，进而招募β-抑制蛋白，导致受体脱敏、内化或启动G蛋白非依赖性信号通路。这种"分道扬镳"的信号模式近年来受到挑战，越来越多的证据表明G蛋白与β-抑制蛋白之间存在着直接或功能性的相互作用。然而，这些相互作用的具体分子机制、结构基础以及功能后果仍然笼罩在神秘之中。
正是为了揭开这一谜团，韩国成均馆大学药学院的Ka Young Chung团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们选择β-抑制蛋白1(βarr1)作为研究对象，重点探讨了其与Gαs和Gαi1两种G蛋白α亚基的相互作用，从结合特性、结构变化到功能调控进行了系统性的深入解析。
研究人员采用了多种前沿的生物物理学和生物化学技术手段，包括微量热泳动(MST)用于精确测定蛋白间的结合亲和力，氢氘交换质谱(HDX-MS)用于分析蛋白质相互作用界面和构象变化，BODIPY-FL-GTPγS测定用于评估G蛋白的激活状态，以及自主研发的β-链XX(βXX)释放测定和细胞内BRET传感器用于监测β-抑制蛋白的激活状态。此外，还通过邻近连接 assay(PLA)在细胞水平验证了蛋白质相互作用的生理相关性。
相互作用不同激活状态的βarr1和Gα
研究团队首先通过MST技术定量分析了βarr1与Gαs/Gαi1在不同激活状态下的结合亲和力。有趣的是，无论是GDP结合的非活性状态还是GTPγS结合的活性状态，Gαs与基础状态的βarr1结合均不显著。而Gαi1的GDP结合状态能与基础状态βarr1发生较弱结合。更重要的是，C端截短的βarr1(βarr1_ΔC)作为"活性构象集合状态"的代表，与所有测试的Gα蛋白都表现出较强的结合能力，解离常数(Kd)在80.68-161.92 nM之间。这表明βarr1的活性构象状态而非Gα的激活状态是决定二者相互作用的关键因素。
βarr1_ΔC与Gαs或Gαi1复合物形成的HDX分析
通过HDX-MS技术，研究人员深入探究了βarr1与Gα相互作用的分子界面。当βarr1_ΔC与GTPγS结合的Gαs共同孵育时，Gαs的αD/αE环区域显示出氘摄取增加，表明该区域构象灵活性增强；而αA/αB环、αE/αF环、switch I和αG/α4环等区域则显示出氘摄取减少，提示这些区域可能参与了复合物形成或发生了构象稳定化。类似的，Gαi1与βarr1_ΔC结合后，在αA/αB环延伸至αB、αD/αE环、switch II、α3螺旋及邻近的α3/β5环以及α5的C端部分均显示出氘摄取减少。值得注意的是，βarr1_ΔC在与Gα结合时仅显示出轻微的HDX变化，主要集中在BIV/BV环、指状环和套索环等区域。
Gαs和Gαi1结构域对βarr1结合的贡献
Gα亚基由Ras样GTP酶结构域(RD)和α螺旋结构域(AHD)组成。为了解析这两个结构域在βarr1结合中的相对贡献，研究团队构建了miniGα(缺失AHD)和独立的AHD结构域。研究发现，对于Gαs，其AHD在介导与βarr1_ΔC的相互作用中起主导作用，而RD的贡献相对较小。相反，对于Gαi1，RD和AHD都对βarr1结合有贡献，且单独任一结构域都足以维持与完整蛋白相当的结合亲和力。这种结构域贡献的差异提示Gαs和Gαi1可能通过不同的结合模式与βarr1相互作用。
βarr1不改变Gα亚基的激活状态
接下来，研究人员探讨了βarr1与Gα相互作用的功能性后果。通过BODIPY-FL-GTPγS实验，他们发现βarr1_ΔC的结合并不影响Gαs或Gαi1的GDP/GTP转换速率，表明βarr1并不作为G蛋白的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)起作用。这一发现提示βarr1-Gα的相互作用可能更多地在空间或变构调控层面发挥作用，而非直接调节G蛋白的催化活性。
Gαs-βarr1相互作用调控βarr1激活状态
一个关键的发现是，Gαs而非Gαi1能够增强V2Rpp诱导的βarr1的βXX释放。当GTPγS结合的Gαs与V2Rpp共同存在时，无论是先加还是后加Gαs，都能显著增强βXX的释放。这一效应需要Gαs的完整结构，因为单独的miniGαs或Gαs AHD均不能模拟完整Gαs的促进作用。这表明Gαs可能通过一种协同机制，增强受体介导的βarr1激活。
细胞中Gαs与βarr1的物理和功能相互作用验证
在细胞水平，通过PLA实验证实了内源性Gαs与βarr1确实存在相互作用，且这种相互作用在血管加压素(AVP)刺激后显著增强。通过BRET传感器进一步验证，Gαs的过表达能够促进βarr1的βXX释放，无论是在基础状态还是AVP刺激条件下。这些细胞实验结果为体外研究发现提供了生理相关性支持。
全长βarr1或Gαs相互作用时的构象变化
尽管在细胞和体外实验中观察到了Gαs对βarr1激活状态的促进作用，但在全长βarr1与Gαs的HDX-MS分析中却未检测到明显的构象变化。研究人员认为这可能反映了二者相互作用的瞬时性和低占据性特点——Gαs可能只是短暂地与βarr1的活性构象集合状态结合，促进βXX释放后即解离，这种短暂的相互作用可能低于HDX-MS的检测阈值。
综合所有研究结果，这项研究为我们理解GPCR信号转导的复杂性提供了新的视角。它不仅证实了β-抑制蛋白与G蛋白之间存在直接的相互作用，还揭示了这种相互作用的构象特异性、亚型特异性以及功能不对称性。特别值得注意的是，Gαs能够促进βarr1的激活，而βarr1却不影响Gα的核苷酸交换活性，这种单向调控模式提示在GPCR信号网络中可能存在更为精细的层级调控。
这项研究的发现与"条形码"理论相呼应，即不同的β-抑制蛋白构象可以对应特定的下游信号输出。Gα与β-抑制蛋白的相互作用可能帮助"塑造"特定的β-抑制蛋白构象，从而导向特定的信号通路。此外，β-抑制蛋白在脱离受体后仍能保持信号能力的状态，可能与研究中使用的βarr1_ΔC所代表的"活性构象集合状态"相似，这为理解受体后信号传递提供了新的思路。
从更广阔的视角看，这项研究不仅增进了我们对基本细胞信号转导机制的理解，也为靶向GPCR信号网络的药物研发提供了新的思路。考虑到GPCR是当今药物开发的重要靶点家族，深入了解其下游信号分子间的交叉对话，对于开发更精准、副作用更小的 therapeutics 具有重要意义。
未来研究需要进一步解析βarr1-Gα复合物的高分辨率结构，并在更复杂的生理环境下验证这些相互作用的功能相关性。此外，探索这些相互作用在疾病条件下的变化，可能为相关疾病的治疗提供新的靶点策略。这项研究为我们打开了一扇窗，让我们窥见了GPCR信号转导网络中尚未被充分认识的复杂性和精巧性，必将激发该领域更多深入的研究探索。
