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本研究针对骨关节炎（OA）中衰老软骨细胞（sCDs）累积及衰老相关分泌表型（SASP）驱动疾病进展的难题，开发了一种抗DPP4抗体修饰的巨噬细胞膜包被的自组装纳米囊泡（BS@MD）。该平台兼具衰老细胞清除（senolytic）和SASP抑制（senomorphic）功能，能精准靶向sCDs，并在溶酶体酸性环境中释放硼替佐米（BTZ）和沙布托克拉（Sab），协同抑制NF-κB和BCL-2通路，有效打破衰老-炎症恶性循环。动物实验表明BS@MD可增强关节滞留、减轻软骨退变和炎症，为OA非手术治疗提供了新策略。
随着全球人口老龄化加剧，骨关节炎（Osteoarthritis, OA）已成为导致慢性残疾的主要疾病之一，给社会带来沉重的经济负担。遗憾的是，目前尚缺乏能够有效延缓疾病进展的疗法。近年来，科学研究逐渐揭示，关节软骨组织中衰老软骨细胞（senescent chondrocytes, sCDs）的异常累积是推动OA发展的一个关键因素。这些衰老细胞不仅丧失了维持软骨稳态的功能，还会分泌大量促炎因子和基质降解酶，这一有害特征被统称为衰老相关分泌表型（Senescence-Associated Secretory Phenotype, SASP）。SASP会像“坏邻居”一样，毒害周围的正常软骨细胞，并加速关节的整体退化。现有的治疗策略，如选择性清除衰老细胞的senolytic药物和抑制SASP的senomorphic药物，面临着靶向性差、无法中和复杂多样的SASP成分以及可能误伤健康细胞等问题。因此，开发一种能够精准靶向sCDs、同时实现清除衰老细胞和抑制炎症双重功效的新型疗法，是OA治疗领域迫切的需求。
针对这一挑战，发表在《Bioactive Materials》上的一项研究提出了一种创新的解决方案。研究人员设计了一种名为BS@MD的双引擎仿生纳米囊泡，它巧妙地将senolytic和senomorphic功能整合于一体。该研究的核心思路是构建一个既能作为“纳米海绵”广泛中和SASP中的有害因子（如IL-6、TNF-α、IL-1β），又能像“特洛伊木马”一样被sCDs特异性吞噬，并在其内部释放药物诱导其凋亡的智能纳米平台。
为了开展这项研究，研究人员综合运用了多项关键技术。他们首先成功建立了前交叉韧带横断（ACLT）手术诱导的小鼠OA模型以及多柔比星（DOX）诱导的体外软骨细胞衰老模型，为后续研究提供了可靠平台。核心技术是载体free的自组装纳米药物技术，通过硼酸酯键协调作用将药物硼替佐米（Bortezomib, BTZ）和沙布托克拉（Sabutoclax, Sab）共装载形成纳米粒（BS）。接着，他们采用了代谢糖工程技术结合无铜点击化学，将靶向sCDs表面标志物DPP4的抗体精准修饰到经脂多糖（LPS）预刺激的巨噬细胞膜上，最终通过挤压法将工程化膜包裹在BS纳米粒外层，形成BS@MD。研究过程中，利用透射电镜、动态光散射、高效液相色谱等对纳米材料进行了系统表征。在功能验证上，通过细胞吞噬实验、流式细胞术、活死染色、酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹、qRT-PCR、RNA测序以及小鼠体内关节注射后的活体成像、Micro-CT、组织病理学染色和免疫组化等多种技术，全面评估了BS@MD的靶向性、疗效及生物安全性。
2.1. 体内外软骨细胞衰老模型的建立
研究人员通过ACLT手术成功构建了小鼠OA模型，Safranin O-Fast Green染色和OARSI评分显示软骨进行性退变，免疫荧光证实p16INK4a+衰老软骨细胞随时间增加。在体外，他们使用DOX诱导原代小鼠软骨细胞建立衰老模型，通过SA-β-gal染色、p16INK4a与DPP4共定位、qRT-PCR、蛋白质印迹和ELISA等一系列实验，证实该模型成功模拟了sCDs的关键特征，包括细胞周期停滞、SASP因子高表达和细胞外基质合成减少，为后续药物筛选和机制研究奠定了基础。
2.2. BS自组装纳米粒机制阐明
通过系统筛选药物比例和光谱学分析（UV-vis、荧光光谱、FTIR），研究人员发现BTZ与Sab以2:1摩尔比可通过硼酸酯键等分子间作用力自组装形成粒径均一、稳定性好的BS纳米粒。竞争实验表明，Sab能竞争性取代指示剂阿尔新红S（ARS）与BTZ的结合，证实配位相互作用是自组装的主要驱动力。
2.3. 工程化BS@MD纳米囊泡的合成与表征
成功构建的BS@MD呈现出典型的核壳结构，粒径约82 nm，表面电位负值增加，证实膜和抗体修饰成功。BS@MD在生理环境和长期储存中表现出良好的胶体稳定性。荧光共定位、SDS-PAGE蛋白电泳和抗体结合实验均验证了巨噬细胞膜的完整包覆和抗DPP4抗体的成功嫁接。药物释放实验显示BS@MD具有pH响应性，在酸性溶酶体环境（pH 5.0）下能快速释放BTZ和Sab，而在生理pH下释放缓慢，实现了药物的靶向控释。
2.4. BS@MD保护软骨细胞和巨噬细胞免受SASP旁分泌效应影响
研究发现，经LPS预刺激的巨噬细胞膜高表达多种细胞因子受体（TNFR1, IL-6Rα, IL-1R1）。ELISA实验证明BS@MD能剂量依赖性地中和IL-6、TNF-α和IL-1β。将sCDs的条件培养基（SCM）经BS@MD预处理后，能显著减轻其对正常软骨细胞（nCDs）的毒害作用，表现为衰老和分解代谢基因表达下调，而软骨基质基因COL2A1表达上调，GAG分泌恢复。同时，BS@MD预处理SCM还能促使促炎的M1型巨噬细胞向抗炎的M2型转化，表明其能调节免疫微环境。
2.5. BS@MD调控巨噬细胞复极化的机制
通过RNA测序分析发现，与SCM处理相比，BS@MD预处理能显著改变巨噬细胞的转录组谱。基因富集分析表明，BS@MD能下调NF-κB信号通路、NOD样受体信号通路和TNF信号通路等炎症相关通路。蛋白质印迹和qPCR结果进一步验证了BS@MD能降低p-NF-κB p65、NLRP3、TNF-α和IL-1β的表达，阐明了其通过抑制NF-κB通路来调节巨噬细胞极化的分子机制。
2.6. BS@MD在体外和体内精准靶向sCDs
细胞实验显示，Cy5标记的BS@MD能被sCDs高效摄取，而在nCDs中摄取很少，靶向效率比非靶向的BS@M高出约4.86倍，且该摄取可被游离抗DPP4抗体竞争性抑制。体内关节注射后，活体成像显示BS@MD在OA小鼠关节内的滞留时间显著长于BS和BS@M，72小时后仍保留94.8%的信号。组织切片免疫荧光证实BS@MD主要定位于关节软骨和滑膜中的p16INK4a+衰老细胞，体现了其卓越的靶向性。
2.7. BS@MD诱导sCDs凋亡
CCK-8和活死染色实验表明，BS@MD能选择性杀伤sCDs，而对nCDs毒性较低。流式细胞术检测细胞凋亡显示BS@MD诱导sCDs凋亡的效果最强。SA-β-gal染色证实BS@MD能有效清除sCDs。ELISA检测显示BS@MD能显著降低sCDs分泌的SASP因子水平。机制研究表明，BS@MD释放的Sab通过抑制BCL-2抗凋亡蛋白、上调促凋亡蛋白Bak/Bax和cleaved caspase-3来诱导凋亡；而BTZ则通过抑制IκBα降解和NF-κB p65磷酸化来阻断NF-κB通路，从而抑制SASP产生。两者协同作用，有效打破了衰老-炎症反馈环路。
2.8. BS@MD减轻衰老负荷并改善OA进展
在ACLT诱导的OA小鼠模型中，BS@MD治疗能显著降低血清中SASP因子水平。Micro-CT分析显示，BS@MD能有效抑制骨赘形成，并改善ACLT导致的软骨下骨硬化（降低BV/TV、Tb.Th、Tb.N，增加Tb.Sp）。组织学染色（H&E, Safranin O-Fast Green, Toluidine blue）表明，BS@MD治疗组的软骨结构完整，蛋白聚糖含量丰富，OARSI和Mankin评分最低。免疫组化显示BS@MD能显著减少关节软骨中p16INK4a、IL-6、IL-1β和TNF-α的阳性信号。此外，BS@MD还能减轻滑膜炎症并促进滑膜巨噬细胞向M2型极化。
2.9. BS@MD在自然衰老OA小鼠模型中的体内治疗效果
在20月龄自然衰老的OA小鼠模型中，BS@MD治疗同样表现出良好的效果，能有效减轻软骨破坏、减少衰老和炎症标志物表达，证实了其在年龄相关性OA中的治疗潜力。
2.10. BS@MD的体内生物安全性评价
系统的生物安全性评估显示，BS@MD治疗后的小鼠血常规、肝肾功能指标均在正常范围内，主要脏器未见明显病理损伤。即使提高给药剂量，也未观察到明显毒性。免疫原性测试表明重复关节内注射BS@MD未产生抗PEG抗体等，具有良好的生物相容性。
综上所述，本研究成功开发了一种新型的双功能仿生纳米囊泡BS@MD。该平台通过其巨噬细胞膜外壳中和广泛的SASP炎症因子，扮演“纳米海绵”的角色以改善关节微环境；同时，借助抗DPP4抗体的精准导航，将载有的BTZ和Sab药物高效递送至sCDs内部，利用溶酶体酸性环境触发药物释放，协同作用于NF-κB和BCL-2关键信号通路，从而实现清除衰老细胞和抑制炎症的双重目标。这项研究不仅为OA的治疗提供了一种极具前景的非手术策略，突破了现有senolytic和senomorphic疗法的局限性，而且其模块化的设计思路也为治疗其他年龄相关性疾病提供了新的技术平台和理论依据。
