《Biochemical Pharmacology》：Effects of CYP3A4 variants and drug–drug interactions on the metabolism of fexinidazole
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TNF-α靶向小分子抑制剂TI-16通过虚拟筛选发现，有效阻断TNF-α与TNFR1结合，抑制凋亡和坏死，减少炎症因子释放，为口服治疗提供新思路。
Hana Seo|Muhammad Haseeb|Sangdun Choi
韩国水原市瑞草大学分子科学与技术系，邮编16499
摘要
肿瘤坏死因子α（TNF-α）是炎症和自身免疫的核心介质，其凋亡和坏死性凋亡途径的失调激活会导致组织逐渐受损。尽管针对TNF-α的单克隆抗体疗法已显示出临床效益，但由于给药方式、免疫原性以及下游信号传导未能完全抑制等问题，仍需探索替代治疗手段。尽管TNF-α在慢性炎症中起着关键作用，但目前尚无小分子抑制剂获得临床批准，仅有少数候选药物处于临床研究阶段。本文报道了一种新型小分子抑制剂TI-16的发现及其作用机制，该抑制剂通过基于结构的虚拟筛选获得，并通过生物物理和细胞实验进行了验证。TI-16能有效保护成纤维细胞免受TNF-α诱导的凋亡和坏死性凋亡，并减少促炎细胞因子的释放。免疫印迹、表面等离子共振和分子动力学模拟分析表明，TI-16选择性地破坏了肿瘤坏死因子α与肿瘤坏死因子受体1（TNF-α/TNFR1）的相互作用，而不影响TNF-α的三聚化。通过同时抑制凋亡和坏死性凋亡信号通路，TI-16克服了现有生物制剂的局限性，为开发新型口服TNF-α靶向治疗药物提供了有希望的候选分子。
引言
肿瘤坏死因子α（TNF-α）是一种在免疫调节中起关键作用的细胞因子，主要由活化的巨噬细胞和单核细胞表达。TNF-α通过三个单体组装成三聚体结构，与两种不同的受体——肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）和肿瘤坏死因子受体2（TNFR2）结合，从而发挥多种生理功能[1]。TNFR1含有一个细胞质死亡结构域（DD），该结构域促进与TNF-α的分子相互作用，激活导致细胞死亡（尤其是凋亡和坏死性凋亡）的细胞内信号通路[2][3]。这些过程是炎症性疾病、自身免疫疾病及癌症病理机制的重要组成部分，因此TNFR1成为治疗干预的理想靶点[4]。TNF-α在病理和生理过程中的双重作用凸显了其临床重要性，促使人们大力开发针对其信号通路的治疗药物[5][6]。TNF-α信号通过核因子κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路传递给下游效应器，最终诱导促炎因子（如白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）和C-X-C基序趋化因子配体1（CXCL1）的表达，同时激活凋亡和坏死性凋亡等细胞死亡通路[7]。
目前已获批准的TNF-α治疗抗体，包括FDA批准的依那西普（etanercept）、英夫利昔单抗（infliximab）和阿达利姆单抗（adalimumab），在克罗恩病、类风湿性关节炎和银屑病等自身免疫和炎症性疾病的治疗中显示出疗效[8][9]。然而，这些生物制剂存在生产成本高、可能具有免疫原性、需静脉注射以及因广泛免疫抑制而增加感染风险等局限性[10]。为解决这些问题，研究人员正在探索多种替代方法，例如UCB-9260（通过稳定TNF三聚体核心来阻止其与TNFR1结合）和SPD304（通过破坏TNF三聚体使其解聚以干扰受体相互作用）[11][12]。尽管取得了进展，但由于TNF-α与受体结合属于蛋白质-蛋白质相互作用，且三聚体结构中缺乏明确的结合位点，小分子TNF-α抑制剂的研究仍面临挑战[13][14]。基于结构的药物设计和计算筛选方法的最新进展彻底改变了这一领域，使得能够发现具有更高特异性和更低脱靶效应的新化合物[15]。TNF-α的高分辨率晶体结构（尤其是UCB-9260复合物，PDB ID: 6OP0）揭示了关键的结合位点特征[11]：结合位点包含一个位于单体界面处的疏水腔，其中Tyr59、Leu57和Tyr119等残基决定了配体的识别和亲和力[11]。这些结构信息使得能够对大型化学库进行虚拟筛选，从而发现类似药物的抑制剂[16]。
鉴于TNF-α在诱导细胞死亡和促炎细胞因子表达中的关键作用[17]，我们推测靶向小分子抑制剂可以有效抑制TNF-α信号通路，为治疗慢性免疫相关疾病提供有前景的策略[18]。在本研究中，我们采用基于结构的虚拟筛选方法寻找能够破坏TNF-α-TNFR1信号通路的小分子，旨在实现有效的细胞死亡通路调节并保持良好的安全性。通过全面的体外验证，评估了这些化合物抑制TNF-α诱导的坏死性凋亡和凋亡的能力，以及其抑制促炎细胞因子表达的效果。结果表明，所选化合物确实破坏了TNF-α-TNFR1相互作用，从而阻断下游信号通路。这些发现揭示了TNF-α抑制的关键分子机制，解决了现有方法的局限性，为未来药物开发提供了宝贵指导。
部分内容
细胞培养
HT-29和SH-SY5Y细胞从韩国细胞系库（KCLB，首尔）获取，L929和THP-1细胞系从美国ATCC（美国马纳萨斯）购买。L929细胞在添加了10%胎牛血清（FBS；Cat# 26140079，Gibco，Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆）和1%青霉素/链霉素（Cat# SV30010，Hyclone，GE Healthcare Life Sciences，犹他州洛根）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。基于结构的虚拟筛选
为了寻找新的TNF-α抑制剂，我们利用人类TNF-α的晶体结构（PDB ID: 6OP0）进行了基于结构的虚拟筛选[11]。通过基于指纹相似性的搜索方法，从包含约2900万种化合物的化学库中筛选出可能与TNF-α结合的化合物。
根据对接得分和先前报道的类似骨架的存在情况，筛选出了约200个高分候选化合物。
讨论
肿瘤坏死因子α（TNF-α）通过诱导促炎信号通路在炎症中起关键作用，导致组织损伤和慢性疾病进展[9][41][42]。现有的TNF-α抑制剂存在高成本、免疫原性和需静脉注射等缺点，因此亟需开发口服可吸收的小分子替代品[44]。本研究通过基于结构的药物发现方法发现了新的TNF-α抑制剂。
关于使用AI辅助技术的声明
在撰写本手稿过程中，作者仅使用ChatGPT（OpenAI）进行语言编辑，以提高文本的清晰度、可读性和科学性。所有手稿内容均由作者审核和编辑，作者对研究的准确性和完整性负全责。作者贡献声明
Hana Seo：撰写初稿、数据可视化、结果验证、方法设计、实验设计、数据分析、概念构建。Muhammad Haseeb：撰写初稿、数据可视化、结果验证、软件应用、方法设计、实验设计、数据分析、概念构建。Sangdun Choi：项目监督、软件使用、资源协调、项目管理和资金筹措。资助
本研究得到了韩国国家研究基金会（National Research Foundation of Korea）的资助，项目编号分别为2022M3A9G1014520和2023R1A2C2003034。利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
