Entinostat 通过组蛋白乙酰化作用上调 AZGP1 的表达，从而抑制肝细胞癌的转移

《Biochemical Pharmacology》：Entinostat suppresses hepatocellular carcinoma metastasis by upregulating AZGP1 through histone acetylation

肝细胞癌（HCC）高死亡率与转移密切相关，恩替替勃通过激活α2-糖蛋白1（AZGP1）表观遗传通路抑制EMT及转移，并证实AZGP1高表达与临床预后改善相关。

　　

蔡伟国|裴新如|叶晓迪|翟燕|吴娜|王紫怡|卢伟

武汉大学中南医院介入诊断与治疗中心，中国武汉430000

摘要

肝细胞癌（HCC）的死亡率很高，主要原因是转移。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）entinostat在此过程中的作用仍存在争议，这限制了其临床应用。本研究旨在明确entinostat在HCC转移中的作用和机制。我们使用体外模型、转录组测序、染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）和原位小鼠模型来评估entinostat对上皮-间质转化（EMT）、侵袭和肿瘤生长的影响。研究结果表明，entinostat能够有效抑制并逆转转化生长因子-β（TGF-β）诱导的EMT，在体内抑制HCC细胞的侵袭和转移，且没有显著的毒性。转录组分析发现α-2-糖蛋白1（AZGP1）是关键靶点。此外，entinostat能够促进AZGP1启动子区域的组蛋白H4乙酰化，从而激活其转录。AZGP1的过表达可以模拟entinostat的效果，而其敲低则大大减弱了这些效果。临床研究表明，高水平的AZGP1表达与更好的预后相关。总之，我们的工作揭示了一个明确的表观遗传途径，即entinostat通过激活AZGP1来抑制HCC转移。这些发现表明AZGP1既是entinostat治疗晚期HCC的关键介质，也可能是其潜在的生物标志物。

引言

肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其特点是肿瘤侵袭性强且预后较差。2014年至2018年间，美国HCC的年龄标准化发病率为每10万人11.5例，5年相对生存率仅为20%[1]。这主要是由于高复发率和转移率，一项针对1,451名接受根治性手术或射频消融治疗的早期HCC患者的研究显示，5年和10年的累计复发率分别为60.3%和71.0%[2]。因此，迫切需要阐明转移的机制并开发新的治疗策略以改善患者预后[3]。

上皮-间质转化（EMT）是癌症进展的关键驱动因素，显著促进了HCC的转移和治疗抵抗[4]、[5]、[6]、[7]。EMT的调控不仅涉及基因改变，还包括表观遗传重编程，特别是组蛋白修饰[8]、[9]、[10]。组蛋白乙酰化可以松弛染色质结构，促进基因转录，而由组蛋白去乙酰化酶（HDACs）催化的脱乙酰化则会促进染色质凝聚和基因沉默[11]。在HCC中，I类HDACs（如HDAC1[12]、HDAC2[13]和HDAC3[14]）的过表达打破了这种平衡，导致关键肿瘤抑制基因的转录抑制，从而促进HCC的进展，使其能够不受控制地增殖并逃避凋亡，最终导致患者生存率降低。

因此，组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）成为一种有前景的治疗策略。HDACi通过诱导细胞周期停滞[15]和凋亡[16]、抑制增殖[11]、血管生成[15]和转移[17]来发挥广泛的抗肿瘤作用。尽管全HDACi可能会产生脱靶效应和毒性，但选择性HDACi具有更良好的安全性[11]、[15]。其中，entinostat作为一种选择性的I类HDACi，在HCC中的应用前景尤为突出，原因如下：（1）该药物在人体内的药代动力学特征明确，包括快速吸收和约2.5至6.25天的长半衰期，便于每周给药一次[18]；（2）它最近在中国（2024年4月）被批准用于HR+/HER2阳性乳腺癌，显示出良好的安全性，显著降低了其在其他适应症（如HCC）临床开发中的风险[19]；（3）临床前研究证实了entinostat通过多种机制在HCC中的疗效，包括激活NTF3/p75NTR-JNK/P38通路[20]、与lenvatinib联合使用时诱导毒性自噬[21]，以及通过vismodegib下调SHH和PI3K/mTOR信号通路[22]。

关于entinostat对HCC转移的影响仍存在明显的研究空白和争议。目前关于entinostat对HCC转移影响的认识仍不明确。与其抗增殖作用相反，一些证据表明entinostat可能通过上调IGFBP-3等基因来增强细胞迁移[23]，这凸显了一个未解决的矛盾和潜在的临床风险。

因此，为了解决这一关键问题并明确entinostat在HCC转移中的确切作用，本研究旨在系统地识别介导其抗转移效果的关键下游效应分子。通过转录组分析和功能验证，我们试图揭示entinostat调节EMT和侵袭的新分子靶点。我们的综合方法结合了体外、体内和表观遗传学分析，旨在阐明从HDAC抑制到转移抑制的明确机制途径，从而为重新利用这种耐受性良好的药物治疗HCC转移提供坚实的理论依据。

部分摘要

肝细胞癌（HCC）仍然是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其特征是肿瘤侵袭性强和预后差。2014年至2018年间，美国HCC的年龄标准化发病率为每10万人11.5例，5年相对生存率仅为20%[1]。这主要是由于高复发率和转移率，一项针对1,451名接受根治性手术或射频消融治疗的早期HCC患者的研究显示，5年和10年的累计复发率分别为60.3%和71.0%[2]。因此，迫切需要阐明转移的机制并开发新的治疗策略以改善患者预后[3]。

上皮-间质转化（EMT）是癌症进展的关键驱动因素，显著促进了HCC的转移和治疗抵抗[4]、[5]、[6]、[7]。EMT的调控不仅涉及基因改变，还包括表观遗传重编程，特别是组蛋白修饰[8]、[9]、[10]。组蛋白乙酰化可以松弛染色质结构，促进基因转录，而由组蛋白去乙酰化酶（HDACs）催化的脱乙酰化则会促进染色质凝聚和基因沉默[11]。在HCC中，I类HDACs的过表达（如HDAC1[12]、HDAC2[13]和HDAC3[14]）使这种平衡偏向脱乙酰化，导致关键肿瘤抑制基因的转录抑制，从而促进HCC的进展，使其能够不受控制地增殖并逃避凋亡，最终导致患者生存率降低。

因此，组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）成为一种有前景的治疗策略。HDACi通过诱导细胞周期停滞[15]和凋亡[16]、抑制增殖[11]、血管生成[15]和转移[17]来发挥广泛的抗肿瘤作用。虽然全HDACi可能会产生脱靶效应和毒性，但选择性HDACi具有更佳的安全性[11]、[15]。其中，entinostat作为一种选择性的I类HDACi，在HCC中的应用前景尤为突出，原因如下：（1）该药物在人体内的药代动力学特征明确，包括快速吸收和大约2.5至6.25天的长半衰期，便于每周给药一次[18]；（2）它最近在中国（2024年4月）被批准用于HR+/HER2阳性乳腺癌，显示出良好的安全性，显著降低了其在其他适应症（如HCC）临床开发中的风险[19]；（3）临床前研究证实了entinostat在HCC中的疗效，包括通过激活NTF3/p75NTR-JNK/P38通路[20]、与lenvatinib联合使用时诱导毒性自噬[21]，以及通过vismodegib下调SHH和PI3K/mTOR信号通路[22]。

关于entinostat对HCC转移的影响仍存在明显的研究空白和争议。目前关于entinostat对HCC转移影响的认识仍不明确。与其抗增殖作用相反，一些证据表明entinostat可能通过上调IGFBP-3等基因来增强细胞迁移[23]，这凸显了一个未解决的矛盾和潜在的临床风险。

因此，为了解决这一关键问题并明确entinostat在HCC转移中的确切作用，本研究旨在系统地识别介导其抗转移效果的关键下游效应分子。通过转录组分析和功能验证，我们试图揭示entinostat调节EMT和侵袭的新分子靶点。我们的综合方法结合了体外、体内和表观遗传学分析，旨在阐明从HDAC抑制到转移抑制的明确机制途径，从而为重新利用这种耐受性良好的药物治疗HCC转移提供坚实的理论依据。

细胞系和培养条件

MHCC-LM3和MHCC-97H HCC细胞系来自上海细胞生物学研究所（中国上海）。这些细胞系在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM，目录号：11965092，Gibco，美国纽约州Grand Island）中培养，培养基中添加了10%胎牛血清（FBS，目录号：C04001-050，Biological Industries，以色列北部Beit-Haemek）、100 U/mL青霉素（目录号：ST486，Beyotime，中国上海）和100 μg/mL链霉素（目录号：ST487）。

Entinostat在体外逆转已建立的EMT并抑制迁移/侵袭

我们证明entinostat不仅可以阻断已建立的EMT，还可以逆转它，这表明它在抑制转移性塑性方面具有双重作用。首先，我们使用标准化的体外生存力测定方法在两种人类HCC细胞系MHCC-LM3和MHCC-97H中评估了entinostat的细胞毒性作用，以量化其抗增殖活性。正如预期的那样，MHCC-LM3和MHCC-97H细胞对entinostat表现出显著的时间和剂量依赖性敏感性，半数抑制浓度

讨论

HCC仍然是一个治疗上的挑战，主要是因为其高转移率。尽管HDACi entinostat显示出抗肿瘤潜力，但其在转移中的作用仍存在争议，有观点认为它可能会增强细胞迁移[23]。我们的研究明确解决了这一争议，证明entinostat在HCC中对EMT和转移具有强大的双重抑制作用。

基于我们的发现，我们描绘了一条从药物作用到

作者贡献声明

蔡伟国：撰写——原始草稿、研究、数据分析、概念化。裴新如：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据管理。叶晓迪：可视化、验证、研究。翟燕：资源提供、研究。吴娜：可视化、软件应用。王紫怡：可视化、数据分析。卢伟：撰写——审稿与编辑、监督、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。