《Biochemistry and Biophysics Reports》：Ectopic endometrial mesenchymal stem cell-derived exosomal miR-4466 promotes angiogenesis by targeting RUNX1 in adenomyosis
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本研究针对子宫腺肌病(AM)中异常血管生成的机制展开探索。研究人员发现，来源于异位子宫内膜间质干细胞(Ec-eMSCs)的外泌体(Ec-exo)及其携带的miRNA-4466，能够通过靶向抑制RUNX1，进而上调血管内皮生长因子A(VEGFA)的表达，从而显著促进人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖、侵袭/迁移和成管能力。这项研究揭示了Ec-exo在AM异常血管生成中的关键作用，为AM的抗血管生成治疗提供了新的潜在靶点和策略。
子宫腺肌病(Adenomyosis, AM)是一种常见的妇科良性疾病，但其引起的月经过多、严重痛经和不孕等问题严重困扰着育龄期女性。尽管其确切的发病机制尚不完全清楚，但病理学上特征性地表现为子宫内膜腺体和间质侵入子宫肌层。值得注意的是，在AM患者的在位和异位内膜中均观察到微血管密度(Microvascular Density, MVD)的显著增加，这些血管往往表现为浅表、杂乱无章且通透性过高。这种异常的血管生成被认为在AM的发生和发展中扮演了至关重要的角色，它可能为异位内膜的存活和生长提供“养料”，并加剧相关临床症状。然而，驱动AM病灶中异常血管生成的具体分子机制仍有待阐明。
在子宫内膜中，位于血管周围的子宫内膜间充质干细胞(Endometrial Mesenchymal Stem Cells, eMSCs)被认为参与了AM的病理过程。特别是来源于异位病灶的eMSCs(Ec-eMSCs)表现出更强的迁移和侵袭能力。近年来的研究逐渐揭示，细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)，尤其是外泌体(Exosomes)，作为细胞间通讯的重要媒介，通过携带蛋白质、信使RNA(mRNA)、微小RNA(microRNA, miRNA)等生物活性物质，在多种疾病中发挥调控作用。已有研究表明，来源于AM在位内膜细胞的外泌体可以促进腺肌病子宫肌层细胞的增殖和迁移，或诱导子宫内膜上皮细胞(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)过程。但是，关于异位eMSCs来源的外泌体(Ec-exo)是否以及如何参与AM中的异常血管生成，目前尚缺乏深入研究。
为了回答上述问题，研究人员在《Biochemistry and Biophysics Reports》上发表了一项研究，系统地探讨了Ec-exo在AM血管生成中的作用及机制。他们的研究发现，Ec-eMSCs通过旁分泌作用显著增强了人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)的血管生成能力，而这种促血管生成作用主要依赖于其分泌的外泌体。进一步的机制研究表明，Ec-exo中富含的miR-4466是关键效应分子，它能够被HUVECs摄取，并通过直接靶向作用于RUNX1基因的3‘非翻译区(3’ Untranslated Region, 3‘UTR)，抑制RUNX1的表达。由于RUNX1是VEGFA的转录抑制因子，其表达下调导致VEGFA表达上调，最终驱动血管生成过程。这项研究不仅揭示了Ec-exo来源的miR-4466/RUNX1/VEGFA轴在AM异常血管生成中的新机制，也为开发针对AM的抗血管生成治疗策略提供了新的思路和潜在靶点。
本研究的关键技术方法主要包括：从AM患者和对照者子宫内膜组织中分离培养正常eMSCs(N-eMSCs)、在位eMSCs(Eu-eMSCs)和异位eMSCs(Ec-eMSCs)，并通过流式细胞术鉴定其表面标志物；采用超速离心法分离外泌体，并通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)、透射电子显微镜(TEM)和蛋白质印迹法(Western Blot)进行鉴定；利用小RNA测序(miRNA sequencing)筛选Ec-exo与N-exo中的差异表达miRNA(DE-miRNAs)，并通过定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)进行验证；通过细胞增殖(EdU法)、细胞侵袭(Transwell小室法)、细胞迁移(划痕愈合实验)和体外成管实验(μ-Slide angiogenesis assay)评估HUVECs的血管生成能力；利用生物信息学分析预测miR-4466的靶基因，并通过双荧光素酶报告基因实验(Dual luciferase reporter assay)和救援实验(Rescue experiment)进行验证；使用蛋白质印迹法和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测相关蛋白表达水平。
3. 结果
3.1. Ec-eMSCs通过旁分泌信号对血管生成过程产生强大影响
研究人员首先建立了一个体外共培养体系，评估了不同来源eMSCs对HUVECs血管生成行为的影响。结果发现，与正常eMSCs(N-eMSCs)和在位eMSCs(Eu-eMSCs)相比，Ec-eMSCs能更显著地促进HUVECs的增殖、侵袭、迁移和体外成管能力。这表明Ec-eMSCs通过旁分泌方式对血管生成过程产生了强大的促进作用。
3.2. Ec-eMSCs的旁分泌促血管生成作用主要由外泌体介导
为了探究外泌体是否介导了Ec-eMSCs的促血管生成作用，研究人员使用外泌体合成抑制剂GW4869预处理Ec-eMSCs，再与HUVECs共培养。结果显示，抑制外泌体释放后，Ec-eMSCs对HUVECs促血管生成能力被显著削弱。这证实了Ec-eMSCs的旁分泌促血管生成效应主要依赖于外泌体。
3.3. 来源于Ec-eMSCs的外泌体在体外发挥显著的促血管生成作用
研究人员成功从Ec-eMSCs的培养上清中分离出外泌体(Ec-exo)，并通过NTA、TEM和Western Blot对其进行了鉴定。细胞摄取实验表明，PKH26标记的Ec-exo能够被HUVECs有效内化。功能实验进一步证实，与正常eMSCs来源的外泌体(N-exo)相比，Ec-exo能显著增强HUVECs的增殖、侵袭/迁移和成管能力。
3.4. 外泌体miRNA测序及qPCR验证差异表达miRNA
通过对N-exo和Ec-exo进行小RNA测序，共鉴定出173个差异表达的miRNA(81个上调，92个下调)。基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析显示，这些差异miRNA的预测靶基因显著富集于血管生成的正调控、VEGF信号通路等生物过程和通路。研究人员进一步通过qRT-PCR验证了11个上调最明显的miRNA，发现miR-4466在Ec-exo中的表达上调最为显著。
3.5. 外泌体miR-4466促进HUVECs的血管生成能力
为了验证miR-4466的功能，研究人员将Cy3标记的miR-4466转染入Ec-eMSCs，发现其产生的外泌体可将miR-4466-Cy3转移至HUVECs内。功能获得(Gain-of-function)和功能缺失(Loss-of-function)实验表明，过表达miR-4466能促进HUVECs的血管生成行为，并上调VEGFA的表达；而抑制miR-4466则产生相反效果。这证明外泌体miR-4466是Ec-exo发挥促血管生成作用的关键因子。
3.6. MiR-4466通过直接靶向RUNX1调控VEGFA表达
通过生物信息学分析预测并结合实验验证，研究人员发现Runt相关转录因子1(RUNX1)是miR-4466的直接靶标。双荧光素酶报告基因实验证实miR-4466可直接结合RUNX1的3‘UTR并抑制其表达。Western Blot和ELISA结果显示，miR-4466过表达会下调RUNX1蛋白水平，同时上调VEGFA的mRNA和蛋白表达水平；抑制miR-4466则效果相反。这表明miR-4466通过靶向抑制RUNX1来解除其对VEGFA的转录抑制，从而促进VEGFA表达。
3.7. MiR-4466通过直接靶向RUNX1促进HUVECs的血管生成
最后的救援实验证实，在过表达miR-4466的同时共转染RUNX1过表达质粒，可以逆转miR-4466过表达所引起的促血管生成效应以及VEGFA的上调。这有力地证明了miR-4466对血管生成的促进作用是通过直接靶向RUNX1来实现的。
4. 讨论与结论
本研究系统地阐明了异位子宫内膜间充质干细胞(Ec-eMSCs)来源的外泌体及其携带的miR-4466在子宫腺肌病(AM)异常血管生成中的作用机制。研究发现，Ec-eMSCs通过旁分泌方式，主要依赖其释放的外泌体，显著增强内皮细胞的血管生成能力。机制上，外泌体可将miR-4466递送至内皮细胞，miR-4466通过直接靶向结合RUNX1的3‘UTR，抑制RUNX1的表达，从而解除RUNX1对VEGFA的转录抑制，最终导致VEGFA表达上调，驱动血管生成。
这项研究的意义在于，首次揭示了Ec-exo来源的miR-4466/RUNX1/VEGFA轴在AM异常血管生成中的关键作用。这不仅深化了对AM疾病机制，特别是血管异常生成环节的理解，而且为开发针对AM的新型治疗方法提供了潜在的分子靶点。例如，靶向抑制miR-4466或利用其拮抗剂，可能成为未来AM抗血管生成治疗的一种新策略，有望改善AM患者的异常子宫出血和生育问题。当然，该研究的结论主要基于体外细胞实验，未来需要利用AM类器官模型或体内动物模型进行进一步验证，并探索其他差异表达miRNA的潜在作用。
