《Bioelectrochemistry》：Electrochemical sensing of organoferrocene ligand interaction with serum albumin in dimethyl sulfoxide media
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比较了四类含铁茂和单糖的多糖配体的电化学行为，发现双铁茂配体因疏水性增强，电极吸附和血清白蛋白结合更显著，但需用DMSO溶解，而DMSO浓度影响蛋白质构象及配体结合，证实电化学方法能有效研究低亲和力配体-蛋白质相互作用及结构变化。
作者：Lucie ?aloudková、Vojtěch Hamala、Peter ?ebest、Marek Zelinka、Hana ?ernocká、Jind?ich Karban、Veronika Ostatná
捷克科学院生物物理研究所，地址：Královopolská 135，612 00 Brno，捷克共和国
摘要
蛋白质-配体相互作用对于理解生物化学反应和途径以及设计新的治疗方法至关重要。在这项研究中，我们比较了四种中性有机铁茂配体的电化学行为，这些配体在单糖单元和铁茂单元的数量上有所不同。碳水化合物基团的存在增加了配体的亲水性，而铁茂单元则增强了其疏水性，这显著影响了它们与电极表面及血清白蛋白的相互作用。与单铁茂配体相比，双铁茂配体在电极表面和血清白蛋白上的吸附作用更为明显。此外，双铁茂配体需要溶解在有机溶剂（如二甲基亚砜）中，这也影响了配体与电极和蛋白质之间的亲和力。我们的研究结果强调了配体性质在决定解离常数及其与蛋白质相互作用（包括非特异性结合）方面的重要性。电化学方法适用于研究疏水性配体与蛋白质的相互作用，因为这些配体通常以微摩尔浓度存在以确保其在水中的溶解性。此外，这些方法对蛋白质的细微结构变化具有很高的敏感性。
引言
蛋白质与各种分子之间的相互作用参与了众多生物过程。蛋白质与其配体之间的结合具有不同的特异性和亲和力[1]。对这些相互作用的表征和深入理解对于发现、设计和开发新药物至关重要[2]。属于碳水化合物结合蛋白家族的半乳糖凝集素与纤维化、癌症和心脏病等严重疾病的进展有关。最近，它们被确定为潜在的治疗靶点[3]、[4]、[5]、[6]。半乳糖凝集素抑制剂的合成及其抑制活性的评估是目前研究的热点领域[6]。已经报道了许多半乳糖凝集素抑制剂，其中一些正在进行临床评估或已经完成[7]、[8]、[9]。半乳糖凝集素及其与抑制剂的相互作用也可以通过电化学方法进行研究[10]，例如含有铁茂（Fc）的新型选择性抑制剂的研究[11]，其中研究了Fc的电活性以及半乳糖凝集素的电活性。
蛋白质及其相互作用（这些相互作用会影响蛋白质的电活性）可以通过恒电流计时电位滴定（CPS）分析在汞电极上进行研究，这要归功于半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸参与氢气释放反应（称为峰H）的能力[12]、[13]。Havran L.等人在2004年发表了首项关于蛋白质相互作用的研究[14]。本研究选择了亲和素和生物素作为配对，因为它们之间具有已知最强的非共价相互作用[15]，解离常数为10?15 M[16]。加入生物素后，峰H减弱，这是由于生物素的结合。Barto?ík M.等人[17]也描述了类似的现象，他们研究了核黄素结合蛋白（RBP）与其与核黄素的相互作用。当RBP与核黄素的比值为1:1时，新形成的RBP-核黄素复合物的峰H明显低于RBP单独存在时的峰H。这种相互作用也相对较强，解离常数约为10?9 M。Galicová T.等人[18]研究了Sambucus nigra中的凝集素（SNA-1）及其与两种唾液酸化三糖的相互作用，其中一种三糖与SNA-1的结合强度远大于另一种。然而，解离常数约为10?7 M。与之前的研究类似，与更强结合力的配体相互作用后，峰H低于蛋白质单独存在时的峰H。在这种情况下，可以区分不同的结合强度。峰H的降低是由于电活性残基在电极表面的可及性降低以及复合物的不同取向[14]、[17]、[18]。当研究SNA-1与前列腺特异性抗原（PSA）的相互作用时，观察到了不同的趋势[18]。这种相互作用导致峰H显著增加，因为不仅PSA的糖链与凝集素结合，其蛋白质部分也结合了凝集素。使用前梯度受体（AGR）蛋白与其野生型和突变型形式以及抗体相互作用后也得到了类似的结果[19]、[20]。所有这些研究都是在相似条件下进行的。
最近，CPS分析被用于研究半乳糖凝集素与有机金属抑制剂的相互作用[11]。合成并表征了一系列含有Fc和钌芳烃结构、连接在乳糖、N-乙酰乳糖胺或硫代二乳糖苷骨架上的半乳糖凝集素抑制剂，因为药理学抑制半乳糖凝集素是一种有前景的治疗策略，可以对抗其致癌效应[21]。Fc半乳糖凝集素抑制剂因其两亲性特征（亲水性的糖部分和疏水性的电活性Fc部分）而受到关注。在设计半乳糖凝集素抑制剂和评估其行为时，必须考虑这种两亲性。在这项研究中，我们研究了四种含有铁茂的半乳糖凝集素结合剂（或配体）及其双重性质对其与带电电极表面和血清白蛋白相互作用的影响。它们相互作用分析中的一个复杂因素是配体在水溶液中的溶解性。在药物发现过程中，二甲基亚砜（DMSO）常被用作样品储存和处理的共溶剂。这种强极性溶剂具有优异的性质，包括高溶解能力、低化学反应性、相对低毒性和低蒸气压[22]。DMSO是一种中性分子，可以与水以任意比例混合，改变表面张力、体积和焓，这是由于水分子与DMSO分子之间的偶极-偶极相互作用和氢键[23]。另一方面，DMSO常用于筛选蛋白质-药物相互作用，因为DMSO与蛋白质的相互作用较弱；因此，当DMSO从蛋白质上解离时释放的能量较少。然而，人们通常很少关注DMSO的添加对非共价复合物结合亲和力的测量结果的影响。已经证明，DMSO对蛋白质结构和功能的影响可能很大，因为它可以作为稳定剂、变性剂、激活剂或冷冻保护剂[24]。DMSO在蛋白质和配体溶液中的存在可以通过双重机制影响它们的相互作用。在低DMSO浓度下，观察到蛋白质结构在溶液中的整体压缩；而在高DMSO浓度下，会导致蛋白质变性[25]、[26]。DMSO对蛋白质的影响也会影响其与配体的相互作用[23]。
材料
牛血清白蛋白（BSA）、二甲基亚砜和其他高等级化学品购自Merck（捷克共和国）。通过280纳米波长处的UV–Vis吸收光谱测定了溶解在0.1 M Tris-HCl（pH 7.4）中的白蛋白浓度。半乳糖凝集素抑制剂的浓度是通过NanoDrop Spectrophotometer ND-1000（ThermoFisher Scientific，美国）在442纳米波长处的Fc吸收来确定的。
合成和配体表征
1Fc-ms和2Fc-ms化合物的合成
半乳糖凝集素拮抗剂的合成
市售的左旋葡聚糖经过六步反应转化为3-叠氮-半乳糖丙酸酯（S1），遵循已报道的程序[28]。S1与炔基铁茂的CuAAC环加成反应生成单Fc单糖1Fc-ms。在另一条路线中，化合物S1经过两步转化为在C-3和C-1位置带有叠氮基团的半乳糖基二叠氮化合物S2。
结论
在这项研究中，我们展示了电化学方法作为研究小分子与蛋白质（这些蛋白质的亲和力相对较低）相互作用工具的潜力。特别是结合计时电位滴定和催化氢气释放的电化学方法对蛋白质结构变化非常敏感[19]、[38]。这些结构变化涉及多种情况，如吸附在电极表面或与其他分子的相互作用。
CRediT作者贡献声明
Lucie ?aloudková：撰写初稿、进行实验、数据管理。Vojtěch Hamala：验证结果、进行实验、数据管理。Peter ?ebest：撰写初稿、进行实验、数据管理。Marek Zelinka：进行实验、数据管理。Hana ?ernocká：撰写、审稿和编辑、验证结果、进行实验、数据管理。Jind?ich Karban：撰写、审稿和编辑、验证结果、项目管理、获取资金。Veronika Ostatná：撰写、审稿和编辑、撰写初稿。
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Jindrich Karban表示获得了捷克科学基金会的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了捷克科学基金会项目编号23–06115S的支持。
