《Biogeotechnics》：Research on microbially induced calcite precipitation (MICP) based on gene vector construction optimization technology for stone relic crack repair
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本研究针对传统石质文物裂隙修复材料相容性差、耐久性不足等问题，通过基因载体构建优化技术，成功实现了巴氏芽孢杆菌脲酶基因簇在枯草芽孢杆菌中的高效表达。获得的重组菌株（Strain B）其最大OD600和脲酶活性分别较原始菌株（Strain A）提升58.8%和44.6%，并在最佳胶结液浓度（1.5 mol/L）和菌胶比（1:1.25）下，2小时内碳酸钙生成率超90%。应用于开封州桥遗址4厘米宽裂隙修复，抗压强度恢复至30.5 MPa，抗折强度达3.9 MPa；2厘米宽裂隙修复后抗折强度甚至提升20%。XRD与SEM分析揭示Strain B能产生双倍方解石，形成更致密矿化产物，显著提升修复体力学性能。该研究为MICP技术在文化遗产保护中的精准应用提供了新策略。
石质文物是人类历史的重要载体，承载着丰富的艺术、科学与文化价值。然而，这些珍贵的遗产长期暴露在户外，经受日晒、温差、干湿循环、雨水侵蚀、地质活动及人为因素的考验，普遍出现了裂隙、剥落、表面风化和孔洞等多种病害。其中，裂隙的发展是最常见且危害最严重的形式，它不仅影响文物的外观，更成为水、气等环境因素侵入内部的通道，最终可能导致文物结构的整体性破坏。
传统的裂隙修复技术主要依赖无机材料（如水硬石灰、砂浆）和有机聚合物材料（如环氧树脂、丙烯酸树脂）。然而，这些材料存在明显局限：无机材料可能含有大量可溶性盐分，加速石材劣化，且其强度与石材本身差异显著，粘结性能较弱；有机材料则面临毒性、固化能力以及在高温高湿环境下耐候性不足的挑战。因此，寻找适用于石质文物、兼具兼容性与耐久性的修复材料，成为文化遗产保护领域亟待解决的难题。
在此背景下，微生物诱导碳酸钙沉淀（Microbially Induced Calcite Precipitation, MICP）技术作为一种新兴的交叉学科方法，展现出巨大潜力。该技术利用微生物的矿化作用，在岩土介质中生成碳酸钙，能显著改善材料的基本性能（如强度、渗透性），并具有低碳排放、干扰小、施工速度快、无需特殊维护等优点。尽管巴氏芽孢杆菌（Bacillus pasteurii）因其高脲酶活性和嗜碱嗜盐特性成为MICP中最常用的菌株，但全球石质文物所处环境千差万别（如酸性、碱性、高盐、干旱、极端温度），单一菌株难以适应所有场景，且其他细菌往往脲酶活性较低，导致修复效果不佳。基因编辑技术为扩展MICP技术的应用范围提供了新思路，通过将特定基因片段导入微生物基因组，可使重组微生物优势表达目标性状。
为了应对上述挑战，发表在《Biogeotechnics》上的研究，由河南大学土木建筑学院的张建伟、郭新伟、杨阳、王培琨、宋宇、于向鹏团队完成，他们开展了一项主题为“基于基因载体构建优化技术的微生物诱导碳酸钙沉淀用于石质文物裂隙修复的研究”。研究人员旨在通过分子生物学手段，优化基因载体构建，将巴氏芽孢杆菌的脲酶基因簇在枯草芽孢杆菌中进行重组表达，从而获得具有高脲酶活性和更强粘结能力的基因工程菌株，并评估其在真实文物遗址裂隙修复中的应用效果。
为开展研究，作者团队运用了几个关键技术方法：首先，采用基因载体构建优化技术，将巴氏芽孢杆菌的脲酶基因簇（UreABCEFGD）克隆至表达载体pHT254，并成功在枯草芽孢杆菌WB600中实现重组表达，获得工程菌株Strain B。其次，系统比较了原始巴氏芽孢杆菌（Strain A）与重组枯草芽孢杆菌（Strain B）的生长特性（通过测定OD600）和脲酶活性（通过电导率法）。接着，通过组分优化实验，确定了两种菌株各自最佳的胶结液浓度和细菌-胶结液体积比，并评估了其碳酸钙生成速率。最后，将优化后的MICP技术应用于模拟开封州桥遗址石墙裂隙（宽度为2厘米和4厘米）的修复，系统评价了修复后试样的抗压强度和抗折强度恢复情况，并利用X射线衍射（XRD）和扫描电子显微镜（SEM）对修复产物的晶体类型和微观结构进行了分析。研究所用石墙仿制试样的原材料严格按照遗址原位成分比例配制。
3.1. 基因载体验证
研究人员以巴氏芽孢杆菌基因组为模板，成功扩增出约5300 bp的脲酶基因簇目标片段。将该片段克隆至表达载体pHT254后，经酶切和PCR验证，确认成功构建了重组质粒pHT254-UreABCEFGD。随后通过电穿孔法将重组质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中，最终获得能稳定表达脲酶基因簇的重组菌株WB600/pHT254-UreABCEFGD（Strain B）。
3.2. 生长特性与脲酶活性
Strain A和Strain B均呈现典型的四个生长阶段：延迟期、对数期、稳定期和衰亡期。Strain B在对数期表现出更快的生长速率，其最大OD600达到2.7，比Strain A（1.7）高出58.8%。同时，Strain B的脲酶活性峰值达到28.2 mmol/(L·min)，比Strain A（19.52 mmol/(L·min)）高出44.6%。这表明重组表达显著提升了菌株的代谢效率和脲酶表达能力。
3.3. 优化实验
通过测试不同胶结液浓度（0.75, 1, 1.25, 1.5, 2 mol/L）和菌胶比（1:0.75, 1:1, 1:1.25, 1:1.5, 1:2）下的碳酸钙生成率，确定了Strain A的最佳条件为胶结液浓度1 mol/L，菌胶比1:1；而Strain B的最佳条件为胶结液浓度1.5 mol/L，菌胶比1:1.25。在此优化条件下，两种菌株在2小时内均能达到90%以上的碳酸钙生成率。Strain B需要更高浓度的底物，与其更高的脲酶活性和代谢消耗相关。
3.4. 力学强度
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抗压强度：对于原始抗压强度为26.4 MPa的石墙，出现2厘米和4厘米裂隙后，强度分别降至23.7 MPa和17.8 MPa。经21天MICP修复后，Strain A修复的裂隙试样强度恢复至接近原始强度（2厘米：26.3 MPa；4厘米：25.7 MPa）。而Strain B修复的试样强度则显著超过原始强度（2厘米：32.7 MPa；4厘米：30.5 MPa），显示出更强的修复能力。
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抗折强度：原始抗折强度为4.3 MPa。经21天修复后，Strain A修复的2厘米和4厘米裂隙试样抗折强度分别为4.1 MPa和3.5 MPa，均低于原始强度。Strain B修复的2厘米裂隙试样抗折强度提升至5.2 MPa，高于原始强度；但其修复的4厘米裂隙试样抗折强度为3.9 MPa，仍低于原始强度。这表明MICP处理对于较宽裂隙（4厘米）的抗折强度完全恢复存在挑战。
3.5. SEM和XRD
XRD分析显示，修复21天后，Strain A产生的碳酸钙中方解石（Calcite）占比为16.3%，球霰石（Vaterite）占比为83.7%；而Strain B产生的方解石占比达到33.3%，是Strain A的两倍。SEM观察进一步证实，Strain A的矿化产物以球霰石为主，方解石少量填充颗粒间孔隙；Strain B则生成了大量规则立方体状的方解石晶体，这些晶体聚集并包裹原始球霰石，形成更致密、稳定的矿化产物，从而显著提升了胶结体的强度和固化性能。
本研究通过基因载体构建优化技术，成功获得了能高效表达脲酶基因的重组枯草芽孢杆菌（Strain B）。该工程菌株相比原始巴氏芽孢杆菌（Strain A），在生长密度、脲酶活性、碳酸钙（尤其是方解石）生成能力以及最终对石质文物裂隙的力学强度修复效果上均表现出显著优势。讨论部分指出，选择枯草芽孢杆菌作为载体是因其分布广、环境适应性强、生长快且对人体无害。研究也提出了未来需要关注的问题，如重组载体在不同环境下的生长特性、MICP处理对文物微环境的改变及其长期影响、修复后文物的整体兼容性（如表面形态、色差、力学强度、渗透性）以及耐候性（如长期干湿循环后的性能退化）等。
该研究的成功实施，不仅为石质文物裂隙修复提供了一种高效、环保的新方法，更重要的是展示了基因工程技术在拓展MICP技术应用边界方面的巨大潜力，为针对特定环境条件定制高效修复菌株奠定了理论基础，对文化遗产的科学保护具有重要的推进意义。
