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本研究开发了一种工程益生菌Met-EcN，可靶向肿瘤微环境中甲硫氨酸的耗竭，激活cGAS-STING通路并增强T细胞浸润，与抗PD-L1抗体联用显著抑制黑色素瘤（63%肿瘤抑制率）和结肠癌（84.6%肿瘤抑制率）的生长。
Tiantian Sun|Qiushuang Zhang|Yicong Dai|Yuhan Liu|Xucong Teng|Jinghong Li
青岛大学生命科学学院生物医学工程研究所，中国青岛266071
摘要
肿瘤细胞与正常组织细胞之间的代谢差异为治疗干预提供了潜在的目标。例如，与正常组织相比，肿瘤细胞对甲硫氨酸的依赖性显著更高。然而，目前的甲硫氨酸限制策略由于全身毒性、患者依从性差以及肿瘤靶向性不足而具有有限的临床应用性。在这项研究中，我们开发了一种工程化的益生菌Met-EcN，它能够在肿瘤微环境中实现甲硫氨酸的靶向消耗。在B16-F10黑色素瘤小鼠模型中，Met-EcN与抗PD-L1抗体的联合使用比单独使用抗PD-L1抗体使肿瘤抑制率提高了63%，同时小鼠的存活率也提高了50%。此外，这种组合显著增强了T细胞的浸润和激活。在MC-38结肠癌模型中，Met-EcN与抗PD-L1抗体的联合治疗使肿瘤生长抑制了84.6%，导致80%的小鼠肿瘤完全消退。Met-EcN消耗甲硫氨酸会导致肿瘤细胞内的甲基化水平降低，从而促进cGAS蛋白从染色质中解离并激活STING信号通路，进而触发先天免疫反应。这项研究为克服肿瘤免疫抵抗提供了一种新的治疗方法。
引言
肿瘤细胞与正常细胞在代谢需求上存在显著差异[1]。例如，肿瘤细胞对甲硫氨酸的依赖性大于正常细胞，这提供了一个潜在的治疗靶点[2]。甲硫氨酸作为一碳代谢的关键成分，在肿瘤细胞内的关键生物过程中起着重要作用，如甲基化反应、多胺生物合成和氧化还原稳态的维持[3]、[4]、[5]、[6]。通过饮食限制或靶向破坏其代谢途径来限制甲硫氨酸的供应，可以影响甲基供体（如S-腺苷甲硫氨酸）的供应[7]、[8]，从而进一步阻碍核苷酸的合成[9]。这种干预已被证明可以增强肿瘤对化疗和放疗的敏感性[10]，最终导致细胞周期停滞和肿瘤增殖的抑制[11]。
目前针对甲硫氨酸的代谢调控策略包括饮食甲硫氨酸限制[12]、[13]、酶促降解[14]以及应用甲硫氨酸类似物来抑制其代谢途径[15]、[16]。然而，这些传统方法在临床试验中遇到了诸多限制，如个体间营养需求的差异、患者长期依从性不佳、潜在的不良反应（如肝损伤和白细胞减少[17]），以及全身甲硫氨酸缺乏对正常组织代谢的意外干扰[18]。这些挑战严重限制了它们的治疗效果和适用性。因此，迫切需要开发能够精确调节肿瘤微环境中甲硫氨酸水平的肿瘤靶向治疗方法。
近年来，作为肿瘤微环境组成部分之一的细菌受到了越来越多的关注[19]。利用合成生物学技术改造细菌，细菌干预疗法再次成为癌症研究和治疗的焦点，特别是在炎症性疾病[20]、[21]、代谢性疾病[22]和恶性肿瘤[23]、[24]、[25]中，为调节肿瘤微环境的发展提供了新的途径。值得注意的是，益生菌因其良好的安全性、与宿主的天然兼容性和易于进行基因工程改造而成为靶向肿瘤治疗的特别有前景的平台[26]、[27]、[28]、[29]。益生菌在治疗癌症方面具有几个独特优势：（1）益生菌可以在肿瘤的缺氧区域主动定植，其浓度比在正常组织中高出数千倍，这一特性克服了传统疗法的靶向限制[30]、[31]；（2）益生菌能够通过鞭毛运动和趋化感应穿透肿瘤组织并到达远端坏死区域，从而克服药物扩散的障碍[32]；（3）通过基因工程改造，益生菌可以表达细胞毒素、免疫调节剂和肿瘤抗原，从而同时具有直接的细胞毒性效应和免疫激活作用[33]、[34]、[35]；（4）某些益生菌菌株是非致病性的，被认为适合用于治疗。目前，已有多种益生菌在肿瘤治疗相关研究中得到研究，包括沙门氏菌 [36]、大肠杆菌 [37]、梭菌属[38]和双歧杆菌 [39]。其中一些已经进入临床试验[40]。例如，重组乳酸乳球菌菌株通过分泌细胞因子IL-17A来抑制肿瘤生长[41]；重组干酪乳杆菌 ATCC 334产生铁铬蛋白，诱导细胞凋亡并发挥肿瘤抑制作用[42]；基因工程改造的大肠杆菌可以将肿瘤组织中积累的代谢废物氨转化为L-精氨酸，从而调节肿瘤微环境的代谢并增强免疫疗法的效果[43]。这些工程化益生菌的成功突显了基于益生菌的抗癌疗法的强大潜力。然而，在甲硫氨酸是癌细胞关键代谢物的情况下，目前还没有能够消耗甲硫氨酸的益生菌。
在这里，我们使用益生菌大肠杆菌 Nissle 1917 (EcN)作为基础菌株，开发了一种高效的甲硫氨酸消耗益生菌Met-EcN。Met-EcN具有特异性地定植肿瘤部位的能力。通过有效消耗肿瘤微环境（TME）中的甲硫氨酸，Met-EcN可以降低肿瘤细胞的甲基化水平，并促进环鸟苷单磷酸合成酶（cGAS）从染色质中解离。这一过程激活了STING（干扰素基因刺激物）通路，从而协同增强肿瘤免疫疗法的效果（图1）。在黑色素瘤和结肠癌的小鼠模型中，Met-EcN与抗PD-L1（程序性死亡配体1）抗体联合使用时表现出显著的抗肿瘤活性。工程化益生菌Met-EcN与抗PD-L1抗体的联合使用将代谢调节与免疫激活相结合，实现了协同的代谢-免疫疗法，展示了合成生物学在癌症治疗中的潜力。
部分摘录
饮食限制甲硫氨酸与PD-L1抗体疗法联合使用可抑制体内肿瘤生长
为了研究甲硫氨酸水平调节对肿瘤中PD-L1免疫疗法的影响及其潜在的全身副作用，我们首先使用B16-F10同源小鼠模型通过饮食甲硫氨酸限制进行了免疫-代谢协同疗法。在这个实验中，携带皮下B16-F10肿瘤的小鼠被喂食缺乏甲硫氨酸的饮食，并接受腹腔注射抗PD-L1抗体（图2a）。如图2b和S2a所示，同时接受这两种治疗的小鼠...
讨论
在这项研究中，我们利用合成生物学方法开发了一种益生菌菌株Met-EcN，它能够选择性地靶向并消耗肿瘤微环境中的甲硫氨酸，以避免全身甲硫氨酸缺乏的副作用。在黑色素瘤（B16-F10）和结肠癌（MC-38）的小鼠模型中，Met-EcN与抗PD-L1免疫疗法的联合使用强烈激活了cGAS-STING信号通路，并增强了T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。
CRediT作者贡献声明
Tiantian sun：撰写——原始草稿、方法学、正式分析、数据管理。Yicong Dai：监督、研究、概念化。Qiushuang Zhang：撰写——原始草稿、方法学、正式分析、数据管理、概念化。Yuhan Liu：撰写——审稿与编辑。Jinghong Li：撰写——审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理。Xucong Teng：撰写——审稿与编辑、验证、监督、方法学、概念化
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了国家重点研发计划（编号2021YFA1200104）、新基石科学基金会和北京生命科学院倡议科学研究计划（编号2024101RPIA02和2024501QPIC05）的支持。
