编辑推荐：
本研究开发了一种口服-尿液联合诊断治疗策略用于炎症性肠病（IBD），通过亲疏水性变化实现非侵入性诊断和靶向药物释放，利用ROS激活荧光前药MB-ASA释放荧光信号MB和药物5-ASA，通过尿液荧光检测实现疾病状态实时监测和治疗验证。
Jiahong Ai|Yurong Zhang|Xingwei Li|Fangjun Huo|Caixia Yin
教育部化学生物学与分子工程重点实验室，山西大学分子科学研究所，太原030006，中国
摘要
我们开发了一种从口腔到尿液的分析诊断方法，用于炎症性肠病（IBD），旨在通过无需侵入性采样的方式提高诊断和治疗的实用性及安全性。该方法利用了与疾病相关的肠道化学变化，这些变化会改变吸收过程，具体是通过荧光前药（MB-ASA）与其活化产物亚甲蓝（MB）之间的疏水性差异来实现的。MB-ASA是通过将MB与5-氨基水杨酸（5-ASA，一种一线IBD治疗药物）通过ROS响应性的脲键连接合而成的。由于具有高疏水性，MB-ASA在口服后会在小鼠体内形成聚集体（水动力直径约为531纳米），从而限制其被肠上皮细胞吸收。在发炎的IBD腔内，活性氧会切割脲键，释放出亲水性的MB和活性5-ASA。释放出的MB更容易被吸收并随尿液排出，从而可以通过监测膀胱和尿液中的荧光来检测IBD。组织病理学比较结果支持了MB-ASA口服前后的治疗效果，这与局部激活和5-ASA的释放一致。这项工作介绍了一种荧光前药平台，它将口服给药与基于尿液的荧光检测相结合，以支持IBD的诊断和治疗评估。
引言
炎症性肠病（IBD）是一种慢性非特异性胃肠道疾病，可分为两种类型：溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）[1]，[2]。全球有超过680万人患有IBD，其症状表现多样，从典型的胃肠道症状（腹痛、血便和里急后重）到常见的肠外表现（如周围关节炎、原发性硬化性胆管炎和结节性红斑）[3]，[4]，[5]。根据最新的流行病学数据，新兴工业化地区的IBD发病率正在迅速上升[6]。研究表明，到2025年中国IBD患者总数可能超过150万[6]。令人担忧的是，长期患有IBD会增加2.4倍的结直肠癌风险[7]，[8]。然而，目前的IBD临床诊断方法存在显著局限性，包括电离辐射风险（钡X射线成像）、侵入性（内镜检查和组织学检查），以及诊断和预后评估的特异性差和无法提供实时反馈（粪便检测）[9]，[10]，[11]。在治疗方面，IBD主要依赖氨基水杨酸类和皮质类固醇等药物，但仍面临一些问题，如药物在肠道黏膜中的浓度低、分布不均或全身性副作用显著[12]。因此，迫切需要开发一种集成了非侵入性早期诊断、空间精确药物递送和实时疾病活动监测的综合诊断系统。
IBD的特点是肠道上皮受损以及与氧化应激相关的炎症微环境[13]，[14]。越来越多的证据表明，氧化应激在IBD的发病机制和进展中起着重要作用[15]。它通过激活NF-κB信号通路促进促炎细胞因子的表达，并促进NLRP3炎性体的成熟[16]。活性氧（ROS）作为代谢副产物产生，对于维持生理水平的正常细胞功能至关重要[15]。然而，持续升高的ROS会导致脂质、蛋白质和DNA的氧化修饰。这种升高的ROS水平已被直接证实与多种疾病（包括IBD）的发病机制有关[17]，[18]，[19]。因此，基于ROS激活的诊断系统在IBD的早期诊断和病变特异性药物释放方面具有巨大潜力。
尿液分析是一种非侵入性且操作简单的临床分析方法，可以通过检测肾脏代谢物有效反映体内的病理状况[20]，[21]。与实时荧光成像（受组织穿透限制）或粪便检测（程序繁琐且时效性不佳）相比，尿液分析结合了快速性和准确性，在感染筛查、代谢性疾病和肿瘤检测中显示出显著价值[22]，[23]。目前，已经开发出具有高肾脏清除率（>90%）的分子探针用于基于尿液的疾病诊断[24]，[25]。然而，这些探针需要静脉注射，这限制了其非侵入性的应用，并带来了临床转化的挑战（例如患者依从性和注射相关风险）。相比之下，从口腔到尿液的检测策略中，探针通过肠道吸收并通过肾脏排出，可以消除穿刺程序，减少侵入性或降低全身性副作用[26]，[27]。然而，这种策略对探针设计有严格要求：必须确保肠道吸收效率、代谢稳定性和肾脏靶向性。迄今为止，尚未有基于从口腔到尿液分析的荧光前药被报道。此外，结合非侵入性荧光成像和治疗成分的荧光前药系统已成为一种新型且有效的疾病诊断和治疗方法。这类荧光前药分子能够实现早期疾病检测和病变特异性药物释放，为治疗难治性疾病带来新的希望[28]，[29]，[30]。因此，我们希望开发一种用于IBD诊断和治疗的口服荧光前药分子。这种前药可以在IBD受影响的肠道中过表达的ROS作用下被激活，随后释放荧光染料和治疗剂。重要的是，释放的荧光染料将在肠道中被吸收并通过肾脏排入膀胱，从而实现非侵入性的尿液分析，用于诊断和预后评估。
在这项工作中，我们利用荧光前药MB-ASA与其活化产物亚甲蓝（MB）之间的疏水性差异导致的肠道吸收变化，开发了一种非侵入性的IBD诊断策略（从口腔到尿液的分析）（图1）。MB-ASA是通过将荧光团MB与5-氨基水杨酸（5-ASA，一种一线IBD药物）通过脲键连接合而成的[31]。体外实验证实MB-ASA可以被三种ROS激活，包括羟基自由基（•OH）、超氧阴离子（O2•?）和过氧亚硝酸盐（ONOO-），从而释放出近红外荧光染料MB和治疗剂5-ASA。水动力直径测量显示，在PBS缓冲液中MB-ASA会自组装成大约531纳米大小的纳米颗粒，这些颗粒在口服后难以被肠道有效吸收。然而，在ROS水平较高的IBD肠道环境中，脲键被切割，释放出亲水性的MB和药物5-ASA。释放出的MB被肠上皮细胞吸收并通过肾脏排出到膀胱。通过分析膀胱和尿液中的荧光实现了IBD的非侵入性诊断。此外，口服MB-ASA前后的病理学分析比较证实，释放出的药物有效治疗了IBD。此外，通过开发新的基于MB的ROS激活探针（MB-1和MB-2），其激活机制与MB-ASA不同，我们证明了这种从口腔到尿液的分析策略在IBD诊断中的更广泛应用性。
MB-ASA的设计与合成
为了开发一种通过从口腔到尿液的分析来诊断和治疗IBD的ROS激活荧光前药，选择了MB作为近红外（NIR）荧光信号报告分子。这一选择基于MB的NIR发射特性、优异的水溶性（有利于肾脏清除）以及生物相容性[25]，[32]，[33]，[34]。此外，5-ASA是一种属于非甾体抗炎药（NSAIDs）类的合成药物，是一线IBD治疗药物
结论
我们开发了一种基于从口腔到尿液分析方法的IBD非侵入性诊断平台。核心创新在于利用ROS激活前药（MB-ASA）与其亲水性代谢物（MB）之间由于疏水性差异而产生的肠道吸收变化。该策略利用了MB-ASA的独特代谢命运：在健康小鼠中，疏水性前药在肠道中未被吸收并随粪便排出。然而，在IBD小鼠中，它会被过表达的ROS切割
CRediT作者贡献声明
Jiahong Ai：撰写——原始草稿，实验研究。Xingwei Li：软件开发，数据分析。Yurong Zhang：验证，数据管理。Caixia Yin：项目管理，资金获取，概念构思。Fangjun Huo：撰写——审稿与编辑，监督
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们感谢国家自然科学基金（编号22325703、22377071、U23A6009）、山西 Scholarship Council支持的研究项目（编号2023-012、2022-002）、山西省科学基金（编号202203021221009），以及2024年三晋人才计划——科技创新领域的项目（自然科学和工程技术领域的创新团队）。
