总结肿瘤细胞外基质的排列方式，以揭示其在诱导恶性细胞表型中的作用——该方法利用了肽液晶水凝胶技术

《Biomaterials》：Recapitulating tumor extracellular matrix alignment to decipher its role in eliciting malignant cell phenotypes using a peptide liquid crystal hydrogel

本研究利用自组装多肽液态晶体水凝胶模拟肿瘤细胞外基质对齐结构，发现其能促进癌细胞增殖、迁移和耐药性，并通过小鼠模型验证了该水凝胶在加速肿瘤生长中的应用。

　　

秦思勇|程伟伟|彭梦云|蔡创|雷琦|黄荣|程银佳|刘文龙|马一涵|张爱青|王磊

教育部催化与能源材料化学重点实验室及中南民族大学催化与材料科学重点实验室，中国武汉430074

摘要

细胞外基质（ECM）的有序微观结构已被认为是某些肿瘤的重要特征，这一特征逐渐被发现与它们的恶性进展有关。然而，大多数人工支架都是各向同性的，无法模拟肿瘤相关ECM的这种有序结构。为了解决这一限制，我们开发了一种基于自组装肽的液晶（LC）水凝胶模型，以再现肿瘤ECM的有序拓扑结构，从而建立一个平台来研究ECM有序性与恶性细胞表型之间的关系。筛选出的肽通过热途径自组装成有序的纳米纤维，形成具有工程化生物特性的LC水凝胶。当肿瘤细胞在肽LC水凝胶中培养时，表现出增强的增殖、迁移、侵袭性和耐药性，这突显了ECM有序性在促进侵袭性表型中的关键作用。利用LC水凝胶模型，我们通过Western blot、逆转录-定量PCR和RNA测序分析，对恶性进展的机制提供了初步见解。此外，通过将LC水凝胶预培养的癌细胞植入C57BL/6小鼠体内，我们建立了一个肿瘤模型，该模型表现出加速的生长。我们的发现表明，自组装肽LC水凝胶可以再现肿瘤ECM的有序性，并有助于开发用于癌症研究和药物筛选的快速进展的肿瘤模型。

引言

癌症在复杂的微环境中发展，这种环境支持其生长、局部侵袭和转移[1]。这一过程涉及癌细胞与其周围环境之间的动态相互作用，这些相互作用不断重塑细胞外基质（ECM），从而促进肿瘤的恶性发展[2]。肿瘤ECM硬度的增加是最被广泛研究的特征[3]，[4]，已有充分证据表明它通过多种途径驱动肿瘤进展[5]，[6]，并通过限制药物渗透性导致治疗抵抗[7]。增强的粘弹性是肿瘤ECM重塑的另一个特征，随后通过整合素-β1-tensin-1-YAP机械转导途径促进细胞增殖和侵袭[8]。除了硬度和粘弹性之外，越来越多的证据表明，在肿瘤进展过程中，ECM中的胶原从最初的随机结构重新排列成有序模式，进一步调节癌细胞的行为[9]，[10]，[11]。例如，ECM中的这种有序纤维为细胞迁移提供了物理导向，促进了肿瘤的侵袭和转移[12]，[13]。胶原纤维的局部有序性还会降低治疗效果，而破坏纤维有序性已被证明可以改善药物渗透性和抗肿瘤效果[14]。与这些发现一致，临床证据也显示，肿瘤ECM的有序性与癌症患者的不良预后相关[15]。

为了研究细胞行为与肿瘤ECM有序性之间的动态相互作用，已经开发了几种技术，如应力控制剪切[16]、电纺[17]、重力诱导沉淀[18]、微流控[19]和生物打印[20]，以工程化ECM胶原的微观结构，从而构建有序的细胞培养支架。然而，这些方法通常依赖于专用设备，并且在原位将肿瘤细胞或外源成分整合到支架中时面临挑战。作为一种替代方案，已经利用去细胞化策略来生成有序的ECM支架。这可以通过在天然ECM中培养与癌症相关的成纤维细胞（CAFs）来诱导纤维定向[21]，或者在合成纳米栅格中培养人类真皮成纤维细胞来生成有序纤维[22]，然后去除细胞以获得无细胞基质。去细胞化的ECM（dECM）保留了天然的生化组成和生物功能性，表现出良好的生物相容性和生物活性。然而，这种方法由于制造过程复杂，纤维有序性可能仅限于一个小范围或受限区域。同时，dECM的成分不明确且不固定，这不可避免地降低了研究的可重复性。因此，迫切需要开发易于制备、具有明确成分和物理化学性质的微观结构有序支架，这些支架能够紧密模拟天然肿瘤ECM。

合成水凝胶具有高水分含量（通常>90%），类似于生物组织，并且其可调节的组成能够模拟天然ECM的物理化学性质，显示出作为三维（3D）支架在癌症研究中的巨大潜力[23]，[24]，[25]。这些系统极大地提高了我们对癌症生物学的理解。最近，寡肽因其温和的合成条件、可定制的结构、优异的生物相容性和多种生物活性以及出色的自组装能力而成为水凝胶支架的有希望的构建块[26]。在这些水凝胶中，自组装的肽纳米纤维与天然ECM中的胶原纤维具有相似的微观结构。此外，控制肽自组装的非共价相互作用使得在微观/纳米级别定制其结构非常方便。在我们之前的研究中，我们通过不同的策略构建了一系列超分子肽液晶（LCs），并确定了它们的纤维有序性[27]，[28]，[29]，[30]，[31]，[32]，[33]。基于这些基础，我们假设可以开发寡肽LC水凝胶来再现肿瘤ECM的有序性（图1）。

为此，系统地设计并合成了一系列寡肽两亲分子，以确定构建LC水凝胶的最佳自组装构建块。其中，C₁₆-VE-CONH₂在生理条件下自组装成纤维状水凝胶，通过加热诱导纤维有序性。在确认了这种水凝胶的生物相容性后，我们研究了其拓扑结构对细胞行为的影响。结果表明，在有序LC水凝胶中培养的肿瘤细胞比在各向同性非液晶（NLC）水凝胶中的细胞具有更高的增殖率，它们的迁移和侵袭能力也更强。此外，在LC水凝胶中培养的细胞对化疗药物的耐药性也有所增加。依靠建立的LC水凝胶模型，初步研究了ECM有序性引发恶性表型的机制。我们还观察到，从体外LC水凝胶培养中获得的侵袭性表型随后促进了小鼠体内的肿瘤生长。因此，建立了一个肿瘤进展迅速的肿瘤模型。总体而言，LC水凝胶在再现肿瘤ECM有序性和生成侵袭性癌细胞方面显示出显著潜力，从而为癌症研究中的高级肿瘤模型构建提供了独特的平台。

节选内容

肽LC水凝胶的制备

两亲肽是通过之前描述的Fmoc固相合成方法手动合成的[34]。为了制备肽LC水凝胶，将一定量的肽固体溶解在去离子水/PBS/DMEM中，以生成最终浓度为1% wt（10 mg/mL）。为了诱导水凝胶中纳米纤维的有序性，将肽溶液的pH值调整为7.4，并用NaOH（1 M）加热至80°C持续30分钟。冷却至室温后，得到LC水凝胶

寡肽两亲分子的设计及其自组装以构建LC水凝胶

我们之前的研究表明，某些由脂肪链尾部与寡聚肽头部连接的两亲肽具有自组装成液晶相（LC相）的能力[29]，[30]，[31]，[32]，[33]。在LC制备过程中，我们注意到其中一些肽可以形成具有明亮双折射性的类似固体的水凝胶。同时，一些二肽两亲分子如C₁₇H₃₅CO-_L-Val-_L-Ala和C₁₇H₃₅CO-_D-Val-_D-Ala的钠盐已被记录为可以自组装

结论

肿瘤ECM的有序性在促进肿瘤恶性发展中起着重要作用。从ECM拓扑结构的角度来看，在本研究中，我们开发了一种肽LC水凝胶来再现肿瘤ECM的有序特征，以便研究ECM有序性在引发恶性细胞表型中的关键作用和潜在机制。通过精细的设计，我们成功筛选出了两亲肽C₁₆-VE-CONH₂，它自组装成具有纳米纤维有序性的各向异性LC水凝胶

CRediT作者贡献声明

程伟伟：撰写——原始草稿、软件开发、项目管理、方法学、研究、数据分析、数据管理。彭梦云：撰写——原始草稿、验证、项目管理、方法学、数据管理。秦思勇：撰写——审稿与编辑、监督、方法学、资金获取、数据管理、概念构思。张爱青：撰写——审稿与编辑、监督、概念构思。王磊：撰写——审稿与编辑、监督

利益冲突声明

已以S. Y. Qin、W. W. Cheng、C. Cai、R. Huang和A. Q. Zhang为发明人提交了肽LC水凝胶作为细胞培养支架的专利申请。作者声明没有利益冲突。

数据可用性

数据将根据请求提供。

利益冲突声明

? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：已以S. Y. Qin、W. W. Cheng、C. Cai、R. Huang和A. Q. Zhang为发明人提交了肽LC水凝胶作为细胞培养支架的专利申请。作者声明没有利益冲突。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号52273313、52325311和52173295）、湖北省自然科学基金项目（优秀研究团队项目编号2025AFA009）以及中南民族大学的中央高校基本科研业务费（编号CZQ24008）的支持。