骨髓源性Dickkopf-1介导缺血性脑卒中后神经血管免疫失调的新机制

《Brain, Behavior, and Immunity》：Dickkopf-1 release by the bone marrow upon ischemic stroke bridges neurovascular and immune deregulations

本研究针对缺血性脑卒中后损伤持续进展的临床难题，揭示了骨髓细胞在亚急性期特异性高表达分泌蛋白Dickkopf-1（DKK1）的关键病理作用。通过转基因小鼠模型及骨髓嵌合体技术，证实DKK1通过破坏神经血管功能稳态、诱发慢性神经炎症，进而加剧脑损伤并诱发焦虑样行为。研究首次发现DKK1中和治疗可显著改善脑血流恢复、促进血管新生并提升神经功能恢复，为卒中治疗提供了新的疾病修饰策略。

　　

当脑血管突然堵塞引发脑卒中，即使成功实现血管再通，许多患者仍会面临神经功能持续恶化的困境。这种被称为"二次损伤"的病理过程，如同隐藏在恢复道路上的暗礁，常常导致认知障碍、焦虑抑郁等长期后遗症。传统治疗手段对此束手无策，科学家们一直在寻找驱动损伤进展的关键分子开关。近年来，一种名为Dickkopf-1（DKK1）的分泌蛋白引起关注——临床观察发现卒中患者血液中DKK1水平越高，预后越差。但令人困惑的是，这种蛋白究竟从何而来？它如何参与脑损伤过程？能否成为新的治疗靶点？发表于《Brain, Behavior, and Immunity》的最新研究揭开了这一谜团。

研究团队首先通过高分辨率原位杂交技术发现：正常大脑几乎不表达Dkk1 mRNA，脑梗死区域也仅见零星分布。而令人意外的是，骨髓细胞中的DKK1蛋白在卒中后3天开始显著增加，1周达到峰值，与血液中DKK1水平变化完全同步。这一发现将源头直指骨髓——这个远离大脑的造血器官，可能是驱动卒中后病理变化的关键策源地。

为验证这一假设，研究人员构建了可诱导表达DKK1的转基因小鼠模型。当在卒中前诱导DKK1高表达时，小鼠出现更严重的脑梗死和脑水肿，神经功能评分持续恶化。通过激光散斑对比成像技术发现，这些小鼠脑血流恢复明显受阻，微血管密度异常且出现大量"停滞血管"。更值得关注的是，星形胶质细胞形成的保护性瘢痕结构紊乱，而小胶质细胞/巨噬细胞在病灶区的分布模式发生异常改变。

当研究人员将目光转向长期影响时，发现卒中后持续高水平的DKK1会诱发慢性神经炎症。转录组分析显示病灶区出现B细胞相关基因和MHC-II分子的异常高表达，同时伴随突触蛋白PSD95和SHANK3的减少。行为学测试表明这些小鼠表现出明显的焦虑样行为，在明暗箱实验中迟迟不敢进入明亮区域。

通过骨髓嵌合体实验，研究最终证实骨髓源性DKK1足以重现上述所有病理改变。流式细胞术分析进一步揭示DKK1会破坏淋巴细胞稳态：增加CD8⁺T细胞和未成熟CD3⁺CD4^-CD8^-双阴性T细胞比例，改变中性粒细胞/淋巴细胞比值。

研究的治疗价值通过DKK1中和实验得到验证：卒中后24小时开始使用WAY262611（一种抑制DKK1与LRP5结合的小分子化合物）治疗，可剂量依赖性地减轻血脑屏障破坏、减少神经元变性，并促进功能性血管新生。接受10 mg/kg治疗的小鼠在旋转杆测试中表现接近假手术组，显示近乎完全的神经功能恢复。

主要技术方法包括：采用tetO诱导型转基因小鼠模型实现组织特异性DKK1表达；通过骨髓移植构建嵌合体小鼠；运用激光多普勒和激光散斑成像技术动态监测脑血流；结合RNAscope多重荧光原位杂交、免疫荧光染色和点模式分析进行空间转录组和细胞分布研究；利用全细胞膜片钳技术记录神经元电活动；通过流式细胞术分析免疫细胞动态变化；采用RNA-seq进行转录组 profiling。

研究结果揭示：

1. 1.
   DKK1脑内表达缺失但骨髓诱导显著：通过RNAscope技术证实Dkk1 mRNA在正常脑组织几乎不表达，卒中后病灶区仅见零星分布，而骨髓细胞DKK1蛋白表达在卒中后1周达到峰值（图1E）。
2. 2.
   早期DKK1诱导加速损伤进展：卒中前诱导DKK1高表达使梗死体积增加约50%（图2C），神经功能评分显示恢复概率降低（图2F），旋转杆测试潜伏期显著缩短（图2G）。
3. 3.
   神经血管功能严重受损：激光散斑成像显示DKK1/ON小鼠脑血流恢复受阻，微血管密度在病灶周边区减少40%（图5G），而病灶中心区异常增加但停滞血管比例上升3倍（图5J）。
4. 4.
   胶质瘢痕空间组织紊乱：点模式分析显示IBA1⁺小胶质细胞空间分布强度增加0.27倍（图3C），星形胶质细胞保护性瘢痕形成受阻，异性星形胶质细胞比例下降60%（图3O）。
5. 5.
   神经元活动异常：膜片钳记录发现卒中侧神经元输入电阻降低，阈值电流增加，动作电位发放频率减少约40%（图4E-H）。
6. 6.
   慢性期出现神经精神并发症：卒中后3天诱导DKK1表达导致1个月后脑萎缩加重（图6N），明暗箱测试中进入明亮区域的潜伏期延长2倍（图6J），突触蛋白PSD95表达下降50%（图6O）。
7. 7.
   骨髓特异性诱导重现病理表型：骨髓嵌合体实验证实仅骨髓细胞来源的DKK1就足以加剧脑损伤（图8H），病灶区GFP⁺骨髓来源细胞浸润增加（附图8H-K）。
8. 8.
   免疫稳态失衡：流式细胞术显示DKK1/ON小鼠外周血淋巴细胞减少，CD4⁺/CD8⁺比值下降，双阴性T细胞比例增加2倍（图9O）。
9. 9.
   转录组特征提示慢性炎症：RNA-seq分析发现病灶区B细胞相关基因（CD79a、CD79b）和血栓形成标志物（vWf、Serpine1）显著上调（图7C）。
10. 10.
    DKK1中和治疗改善预后：WAY262611治疗使IgG渗出减少60%（图10F），神经元变性密度下降50%（图10H-I），微血管停滞现象改善70%（图10O）。

这项研究首次系统阐明了骨髓源性DKK1在卒中后神经血管免疫失调中的核心作用。不同于传统认为的脑内源性损伤因子，DKK1作为"骨髓-大脑"对话的关键介质，通过破坏血脑屏障、阻碍血管新生、诱发慢性炎症等多重途径驱动二次损伤。更重要的是，研究证实针对DKK1的中和治疗具有明确的神经保护作用，且治疗时间窗可延长至卒中后亚急性期。这一发现不仅为理解卒中病理机制提供了新视角，更开辟了以骨髓为靶点的卒中治疗新策略，对临床转化具有重要指导意义。