《Environmental Pollution》：TRPM2 mediates tire-derived pollutant 6PPD-Q-induced male reproductive impairment via autophagy in mice
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6PPD-Q通过氧化应激和自噬功能障碍导致雄性小鼠睾丸损伤，影响精子生成和血睾屏障完整性，TRPM2信号通路是关键机制。
周宇航|臧振杰|王星祖|冯云浩|王振清|李子瑶|刁同祥|傅强|张慧
山东省第一医科大学附属山东省医院泌尿科，济南，250021，中国
摘要
N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基-p-苯二胺醌（6PPD-Q）是轮胎橡胶抗氧化剂6PPD的氧化产物。近期研究在各种环境介质（包括水、空气和土壤）以及人体生物样本（如尿液、母乳、血液和脑脊液）中检测到了6PPD-Q。这些发现表明其在环境中的广泛存在及其通过多种途径进入人体的可能性。尽管先前的研究表明6PPD-Q具有多器官毒性，尤其是在肝脏和神经系统，但其对男性生殖系统的影响及其相关分子机制尚未得到充分探讨。我们建立了雄性小鼠的慢性暴露模型，以系统评估6PPD-Q对睾丸的毒性作用及其潜在机制。研究结果表明，6PPD-Q在睾丸组织中积累，导致组织损伤，表现为血清睾酮水平降低、精子质量下降、生精上皮脱落以及血睾屏障功能障碍。机制研究表明，这些效应与自噬受损、氧化应激增加和睾丸组织中细胞凋亡增多有关。通过整合网络毒理学和转录组学分析，我们确定TRPM2（瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员2）介导的自噬功能障碍是6PPD-Q诱导的睾丸损伤的关键因素。本研究系统揭示了6PPD-Q对雄性小鼠生殖系统的毒性作用，并阐明了其背后的分子机制。这为理解新兴环境污染物对生殖健康的风险以及制定预防策略提供了重要证据。
引言
工业化和城市化的快速推进导致了多种环境污染物的出现，这些污染物对生态系统和人类健康构成了重大威胁。N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基-p-苯二胺（6PPD）是一种常用的橡胶轮胎抗氧化剂，可防止轮胎氧化降解，从而延长其使用寿命（Bohara等人，2024年）。由于6PPD在电缆、软管、鞋类和皮带等橡胶制品中的广泛应用，其释放到环境中的可能性显著增加，从而增加了人类接触的风险（Cao等人，2022年）。6PPD释放到环境中后，会与臭氧反应生成6PPD-醌（6PPD-Q），这是一种高度稳定、有毒且持久的转化产物（Jiang等人，2024年）。
一项里程碑式的研究指出，6PPD-Q是美国科霍鲑鱼（Oncorhynchus kisutch）在暴雨排水后急性死亡率的关键致病因素（Johannessen等人，2022年）。这一发现引发了科学界对这种新兴污染物的极大兴趣。后续研究证实了6PPD-Q在空气、水和土壤等多种环境介质中的广泛存在（Chen等人，2023年）。与母体化合物6PPD相比，6PPD-Q的水解半衰期显著更长（Hiki和Yamamoto，2022年），这是其在许多国家道路径流和接收水体中普遍检测到的关键原因。受道路径流影响的城市水道中6PPD-Q的浓度在暴雨期间达到峰值。在加拿大多伦多地区的暴雨排水样本中检测到2.8 μg/L的浓度（Ji等人，2022年），在加拿大萨斯卡通的道路径流中检测到1,400 ng/L的浓度（Hua等人，2023年），而在美国西雅图的道路径流中检测到最高的19 μg/L浓度（Johannessen等人，2022年）。此外，含有6PPD-Q的道路灰尘也存在于大气颗粒物中，其浓度在中国为3至509 ng/g（He等人，2023年），在日本为116至1,238 ng/g（Fang等人，2023年）。这种广泛的环境存在表明，6PPD-Q可能通过摄入和吸入等多种途径在生物体内积累。与这些发现一致，北京市场上销售的鱼类以及生活在受污染地区的儿童的尿液中检测到了6PPD-Q，其浓度明显高于未受污染地区的儿童（Ji等人，2022年）。最近的全面评估强调了6PPD和6PPD-Q在城市环境中的复杂暴露途径，引发了对其对人类健康潜在风险的担忧（Xu等人，2025年）。因此，6PPD-Q被认为是一种值得关注的新兴污染物。
早期研究将6PPD-Q确定为与城市径流相关的科霍鲑鱼死亡的主要毒物（Tian等人，2021年）。在斑马鱼中，暴露于500–1000 μg/L浓度的6PPD-Q会导致严重的运动缺陷和神经传导障碍（Fu等人，2024年）。哺乳动物研究显示，长期暴露于6PPD-Q会导致多器官损伤，影响肺、肾、肝和睾丸（He等人，2023年）。进一步的证据表明，6PPD和6PPD-Q都会干扰小鼠的肝脏代谢，其中6PPD-Q通过上调免疫相关基因转录来引发免疫反应（Fang等人，2023年）。此外，6PPD-Q还通过激活芳基烃受体（AhR）促进心肌细胞衰老，导致活性氧（ROS）过度产生和自噬通量受损（Fu等人，2024年）。
6PPD-Q的生殖毒性最初在环境敏感的模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中被发现，长期暴露会导致生殖细胞凋亡，可能与DNA损伤和细胞尸体吞噬增加有关（Hua等人，2023年）。先前对6PPD-Q类似物DPPD的研究已经表明这类化合物具有生殖危害（Matsumoto等人，2013年）。最近，张等人利用稳定同位素辅助质谱技术证实了6PPD-Q在小鼠睾丸组织中的持续积累（Zhang等人，2024年）。同时期的研究还表明，6PPD-Q会对精液质量和体外受精结果产生负面影响（Yao等人，2024年）；然而，这些研究主要集中在生殖细胞上，未全面评估睾丸损伤。
本研究严格探讨了6PPD-Q对雄性小鼠睾丸结构和功能的影响，并阐明了其背后的分子机制。我们通过暴露于6PPD-Q建立了睾丸损伤的小鼠模型，并探索了相关的分子途径。鉴于6PPD-Q可通过吸入、摄入和皮肤接触进入体内，并且在水生环境中普遍存在，我们选择腹腔注射作为暴露途径以模拟慢性内部积累。这一选择得到了证据的支持，即肠道排泄是6PPD-Q及其代谢物的主要消除途径（Zhang等人，2024年；He等人，2023年）。我们使用液相色谱-质谱（LC-MS）定量了睾丸中的6PPD-Q水平以验证暴露模型，并通过透射电子显微镜检查了超微结构变化并评估了生殖功能终点。通过整合网络毒理学和转录组分析，我们确定了潜在的毒性靶点。计算预测结果通过分子生物学实验得到了验证，证实了6PPD-Q诱导的睾丸损伤机制。我们的工作系统地研究了6PPD-Q这种新兴环境污染物对雄性小鼠生殖系统的毒性作用，阐明了其机制基础，并强调了环境污染物对生殖健康的日益严重的威胁。这些发现为制定保护生殖功能免受污染物影响的策略奠定了基础。
试剂
6-苯二胺醌（6PPD-Q；纯度≥98%；CAS编号2754428-18-5）购自MedChemExpress（美国新泽西州蒙茅斯 junction）。医用级橄榄油（CAS编号8001-25-0）购自Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.（中国上海）。
实验小鼠和方法
健康的6周龄雄性BALB/c小鼠购自济南鹏跃实验动物繁殖有限公司（中国济南；认证编号SCXK(Lu)2022-0006）。实验前，小鼠已适应实验室环境。
长期暴露于6PPD-Q会导致小鼠睾丸积累和损伤
为了评估长期暴露于6PPD-Q对雄性生殖健康的影响，我们将6周龄的雄性BALB/c小鼠适应一周后随机分为两组。根据先前的研究（He等人，2023年），我们将6PPD-Q的LD50值的10%至20%定为亚急性毒性剂量，并在初步实验中进行了验证（表S6）。处理组接受6PPD-Q（4 mg/kg）的腹腔注射，而对照组接受相同体积的生理盐水。
讨论
汽车需求的增加导致了轮胎产量的上升，从而使轮胎衍生物成为城市环境污染的重要来源。6PPD是一种在轮胎橡胶中使用的抗氧化剂，数十年来一直被使用，但由于6PPD-Q（通过臭氧氧化6PPD形成的新型污染物）所伴随的健康风险，最近受到了关注。多项研究表明，暴露于6PPD-Q会导致哺乳动物的多器官损伤。
结论
本研究系统研究了新兴污染物6PPD-Q对雄性生殖系统的生殖毒性及其机制。它提供了关于6PPD-Q对哺乳动物健康影响的重要毒理学数据。我们的结果表明，长期暴露于6PPD-Q会破坏小鼠睾丸的血睾屏障，增加氧化应激和细胞凋亡，从而损害生精微环境。
作者贡献声明
王振清：研究。冯云浩：软件、概念设计。王星祖：软件、方法学。臧振杰：写作——审稿与编辑、可视化、数据分析。周宇航：写作——初稿、软件、方法学、研究、数据分析、数据管理。张慧：验证、监督、资源获取、项目管理。傅强：监督、资金获取、概念设计。刁同祥：研究、数据分析。李子瑶：研究
未引用参考文献
Liu等人，2025年；Zhang等人，2023年。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
资助
本研究得到了“传统中医与西医合作项目——男性不育症（项目编号ZDYN-2024-A-082）”；“健康促进计划——实体瘤研究项目（WSJK-XH20250501）”；“山东省自然科学基金（ZR2023QH325）”和“山东省自然科学基金（ZR2021QH366）”的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们感谢山东省泌尿器官和功能重建工程实验室的成员们对这项研究的讨论和指导。
