《Environmental Pollution》：Genome-Wide DNA Methylation Response of
Paralichthys olivaceus to
Ulva prolifera Decomposition Effluent Stress
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乌贼分解导致海水酸化和营养波动，研究 Paralichthys olivaceus 肝脏DNA甲基化动态，发现73% CpG甲基化，7,519个差异甲基化区域，涉及MAPK信号通路、p53通路及脂代谢，关键基因tet3、mapk12a、irf10验证后为表观遗传适应机制。
余洋|史坤鹏|马杰|常梦阳|李一帅|谭素旭|张瑞雪|任新璐|史晓勇|沙振霞
中国山东省青岛市青岛大学生命科学学院水生生物技术研究所，邮编266071
摘要
Ulva prolifera在黄海的分解对生态系统构成了严重威胁，导致海水酸化、营养物质波动以及溶解氧水平变化。以往的研究主要集中在U. prolifera的分解过程及其对生物元素的影响上，而对其对鱼类遗传资源的影响，尤其是在表观遗传水平上的影响的研究仍较为有限。本研究采用全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）技术，并结合已发表的转录组数据，研究了Paralichthys olivaceus在暴露于分解后的U. prolifera废水（浓度为0.28 g/L）14天后的肝脏中DNA甲基化动态变化。研究结果表明，暴露于U. prolifera分解废水后，整体甲基化水平下降，这可能是由于去甲基化基因tet3的表达上调所致。共检测到7,519个差异甲基化区域（DMRs），其中4,290个为高甲基化区域，3,229个为低甲基化区域，其中2号染色体上的DMRs数量最多。通过对差异甲基化启动子（DMPs）的功能富集分析，发现了包括MAPK信号通路、p53信号通路、α-亚麻酸代谢和Th17细胞分化在内的关键通路。我们推测P. olivaceus通过增强脂质代谢来提供额外能量并支持细胞增殖，作为适应机制。此外，选取了两个候选基因（mapk12a和irf10）通过亚硫酸盐测序PCR（BSP）和定量实时PCR（qRT-PCR）进行进一步验证。总体而言，这些发现为P. olivaceus对藻类分解引起的应激的表观遗传反应提供了新的见解，为评估赤潮的生态毒性奠定了分子基础。
引言
自2007年以来，中国黄海Ulva prolifera的夏季大规模繁殖已成为全球最大的赤潮事件，带来了显著的生态后果（Liang等人，2021年）。在分解过程中，U. prolifera会在底部水域产生缺氧和酸性环境，深刻改变沿海生态系统和微生物群落（Chen等人，2020年）。研究表明，这种分解过程对Haliotis discus hannai和Paralichthys olivaceus等海洋生物具有急性毒性，导致死亡率增加（Fan等人，2022年；Wang等人，2011年）。然而，尽管这些生物学效应已有充分记录，但鱼类对U. prolifera分解引起的应激的表观遗传反应仍知之甚少。
越来越多的证据表明，鱼类利用表观遗传机制，尤其是DNA甲基化，来调节基因表达并适应环境压力（Budd等人，2022年；Li等人，2025年；Tang等人，2023年）。例如，温度变化会改变Micropterus salmoides的CpG甲基化模式（Lin等人，2025年），而缺氧会诱导斑马鱼的甲基组和转录组变化（Anastasiadi等人，2017年）。此外，将Dicentrarchus labrax从海水转移到淡水中会引发明显的DNA甲基化动态变化，并改变与渗透调节相关的基因表达（Blondeau-Bidet等人，2023年）。这些研究强调了DNA甲基化作为一种保守的应激响应机制，但这些研究仅限于单一压力因素。相比之下，U. prolifera分解产生的废水同时施加了多种压力因素，共同构成了独特的环境挑战（Gan等人，2025年）。
作为东亚重要的经济鱼类，P. olivaceus在中国、日本和韩国广泛分布（Lee等人，2023年；Wang等人，2023年）。由于环境退化和过度捕捞，黄海的野生种群严重依赖人工增殖计划（Lu等人，2018年）。关键的是，这些增殖活动往往与U. prolifera的繁殖高峰期重叠，使幼鱼直接暴露在复杂的藻类分解废水中。这使得P. olivaceus>成为研究其对赤潮应激的生物学反应的理想模型，尤其是在渔业可持续性方面。然而，P. olivaceus在赤潮应激下的全球DNA甲基化动态及其与基因表达的关系仍不清楚。
为填补这一知识空白，我们对暴露于分解后的U. prolifera废水（0 g/L作为对照组，0.28 g/L作为处理组）14天的P. olivaceus肝脏组织进行了全基因组DNA甲基化分析。我们识别出了差异甲基化区域（DMRs），特别关注启动子区域，并进行了功能富集分析，以将甲基化变化与生物学过程联系起来。本研究旨在揭示赤潮应激下的全球DNA甲基化动态，并阐明甲基化如何调节P. olivaceus中的应激响应基因。我们的研究结果将有助于加深对赤潮灾害表观遗传适应机制的理解，对渔业管理具有启示意义。
实验部分
U. prolifera和实验鱼类的预处理
2023年6月，我们在青岛石崂湾海滩（120.25°E，35.96°N）采集了新鲜的U. prolifera样本。用海水彻底冲洗以去除表面杂质后，将样本运送到实验室并进一步清洗以确保纯度。处理后的藻类储存在-20°C（MELNG，中国）条件下备用。为了制备分解后的藻类废水，将1,000克新鲜U. prolifera培养在含有20升水的25升高密度聚乙烯容器中
Paralichthys olivaceus肝脏中DNA甲基化的全基因组分析
从代表两个实验组的六个样本中制备了基因组DNA文库，并进行了亚硫酸钠处理。经过质量控制和过滤后，C组和U组分别获得了16.33 Gb和17.15 Gb的清洁碱基序列。这些清洁后的读段随后与P. olivaceus参考基因组进行了比对，比对率为55.93%和52.20%，亚硫酸盐转化效率超过99%（表1）。平均胞嘧啶覆盖率
Paralichthys olivaceus肝脏组织中的全基因组DNA甲基化模式
在本研究中，我们使用WGBS技术研究了暴露于分解后的U. prolifera废水中的Paralichthys olivaceus肝脏组织的DNA甲基化变化。我们发现DNA甲基化主要发生在CpG位点，平均甲基化水平为73%，而CHG和CHH位点的甲基化水平较低，平均仅为0.5%。这些结果表明，U. prolifera分解产物引起的表观遗传改变主要影响CpG富集区域。
结论
本研究利用WGBS技术研究了暴露于U. prolifera分解废水中的Paralichthys olivaceus肝脏组织的全基因组DNA甲基化模式和甲基化相关基因表达谱。通过BSP验证了甲基化数据，确保了结果的准确性和可靠性。去甲基化基因tet3在Paralichthys olivaceus应激反应中起到了关键调节作用。对差异甲基化基因的功能富集分析进一步揭示了相关基因的作用
CRediT作者贡献声明
任新璐：研究工作。史晓勇：研究工作。张瑞雪：研究工作。马杰：研究工作。常梦阳：研究工作。李一帅：研究工作。谭素旭：研究工作。沙振霞：监督、项目管理、资金获取。余洋：撰写——初稿、方法学设计、数据分析。史坤鹏：撰写——修订与编辑、概念框架
伦理合规性
所有动物实验均遵循青岛大学伦理委员会批准的指南（编号QDU-AEC-202302）进行。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：42276218）和山东省院士专项计划（项目编号：2023ZLYS02）的支持。
