单细胞转录组学与空间蛋白质组学的结合，揭示了糖尿病性白内障中吞噬细胞类型特异性的免疫调节机制

《Experimental Eye Research》：Single-cell transcriptomics combined with spatial proteomics defines phagocytes type-specific immune regulation in diabetic cataract

糖尿病性白内障（DC）的免疫机制研究：通过单细胞RNA测序发现糖尿病大鼠晶状体中单核吞噬细胞比例显著增加，其中促炎M1巨噬细胞增多而抗炎M2减少；免疫荧光染色和AS-OCT证实DC患者前囊膜免疫细胞浸润更显著，且前囊膜高反射点更明显；蛋白质组学分析鉴定38个差异蛋白，GO和KEGG富集分析揭示免疫调节与K63泛素化通路关键作用。

　　

李鹏飞|王荣|钱晓曦|文梦琪|严子豪|程晓|戴玉鑫|周乐宇|朱曦|陈伟|关怀进|季敏

中国江苏省南通市南通大学附属医院眼科研究所

摘要

糖尿病性白内障（DC）是糖尿病患者视力受损的主要原因，其发病机制复杂，涉及免疫介导的机制。本研究旨在利用多组学数据探讨糖尿病性白内障晶状体中免疫细胞的特征及其潜在机制。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术鉴定糖尿病和正常大鼠晶状体样本中的细胞类型及其比例，并利用基于串联质量标签的定量蛋白质组学方法深入分析免疫靶点及晶状体病理机制。在差异蛋白分析中，运用了基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）进行通路富集分析。前段光学相干断层扫描（AS-OCT）可用于识别糖尿病性白内障患者中的高反射点。对年龄相关性白内障（ARC）和DC患者的晶状体前囊膜进行了免疫荧光染色。scRNA-seq鉴定出五种细胞类型，其中单核吞噬细胞在糖尿病大鼠中的比例显著高于正常大鼠。进一步分析显示，促炎型M1巨噬细胞数量增加，而抗炎型M2巨噬细胞数量减少。免疫荧光染色显示，DC患者晶状体前囊膜上的免疫细胞数量明显多于ARC患者。AS-OCT结果显示，DC患者晶状体前囊膜上的高反射点比ARC患者更为明显。此外，AS-OCT还可用于区分DC患者晶状体混浊区和透明区。蛋白质组学分析发现，DC患者晶状体混浊区与透明区有38种差异表达蛋白，其中17种上调，21种下调。上调的蛋白MIF是一种重要的巨噬细胞趋化因子，可能在调节晶状体免疫中起关键作用。GO和KEGG通路分析表明这些变化与免疫调节和蛋白质泛素化通路相关，尤其是淋巴细胞和白细胞的激活以及K63泛素化过程。本研究证实了免疫机制（尤其是单核吞噬细胞）在糖尿病性白内障发展中的作用。免疫调节的上调和蛋白质泛素化途径的改变为DC的治疗提供了潜在靶点，需进一步研究以明确这些免疫细胞的特定功能并设计针对性疗法。

引言

糖尿病患者可能出现多种并发症，影响身体多个部位，尤其是血管、神经、眼睛和肾脏（Oputa和Oputa，2024）。眼部并发症包括糖尿病性角膜病变（DK）、糖尿病性白内障（DC）、糖尿病性视网膜病变（DR）和糖尿病性视神经病变等（Wang等人，2024b）。DC是糖尿病患者视力问题的主要原因（Pascolini和Mariotti，2012）。DC的发病机制较为复杂，已有多种理论解释，包括高渗透压、多元醇代谢异常、氧化应激和非酶促糖基化产物的积累（Mrugacz等人，2023）。遗憾的是，目前尚无有效药物可以减缓或逆转DC的发展。因此，深入研究DC的发病机制对于开发新的靶向治疗方法至关重要。近年来，关于无血管晶状体可能触发免疫反应的假说引起了广泛关注（Menko等人，2021；Thompson等人，2022；Walker和Menko，2021）。

过去，眼球被认为是免疫豁免区域，尤其是无血管的晶状体（Stepp和Menko，2021）。最新研究表明，晶状体内存在多种驻留免疫细胞，包括巨噬细胞和树突状细胞（Menko等人，2021）。这些细胞在胚胎发育期间形成并持续存在至成年（Menko等人，2021），约占晶状体细胞的3%，在病理条件下可清除细胞碎片、凋亡细胞和病原体（Menko等人，2021）。然而，关于DC中免疫机制的研究仍较为有限。

树突状细胞（DC）是连接先天免疫和适应性免疫的关键抗原呈递细胞，通过激活T细胞反应发挥重要作用。人类DC分为三类：常规DC（cDC）、浆细胞样DC（pDC）和单核细胞来源的DC（moDC）（PMID: 29727728）。作为强大的抗原呈递细胞，DC具有高度异质性和显著的细胞表型及功能可塑性，能调节免疫反应。DC的内在机制和复杂的外部环境信号使其具有诱导保护性免疫或自我耐受的能力。DC与其他免疫系统细胞之间的相互作用决定了这种反应的性质，这取决于DC的成熟状态和亚型以及组织微环境（PMID: 29242034）。最新研究发现晶状体内存在成熟的DC群体（PMID: 33710665-35123994），但其在糖尿病性白内障中的发育和功能尚不清楚。

为进一步明确DC晶状体中受影响的免疫细胞类型及相关通路，我们采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析细胞聚集和比例的变化。免疫荧光染色显示DC患者晶状体前囊膜上的免疫细胞数量多于ARC患者。AS-OCT检测发现DC患者晶状体前囊膜上的高反射点更为明显，同时有助于区分DC患者晶状体混浊区和透明区。蛋白质组学分析鉴定出38种在混浊区差异表达的蛋白，GO和KEGG分析将这些蛋白与免疫调节和蛋白质泛素化通路相关联。本研究的核心目标是全面理解导致DC的免疫机制。

AS-OCT检测糖尿病性白内障患者的高反射点

所有患者的AS-OCT检查由同一位医生使用Intalight OCT（DREAM OCT?）设备完成。患者被要求保持双眼直视，并将待检查的眼睛与探头对齐。散瞳后进行16线扫描。扫描参数设置如下：扫描类型：前段；模式：AS Star R16，激活晶体晶状体模式；扫描长度：16

糖尿病大鼠和正常大鼠晶状体中细胞类型的鉴定

本研究获取了两组新鲜分离的糖尿病和正常大鼠的完整晶状体样本用于scRNA-seq分析（图1A）。根据典型基因标记物的表达情况，手动识别出不同细胞类型：晶状体上皮细胞（簇1）、晶状体纤维细胞（簇2）、单核吞噬细胞（簇3）、增殖细胞（簇4）和未知细胞（簇5）（图1B）。单核吞噬细胞占...

讨论

历史上，非先天性白内障被认为是由于晶状体上皮细胞（LEC）死亡及由此导致的白内障形成（Li等人，1995；Li和Spector，1996；Wang等人，2015）。然而，其他导致晶状体混浊的机制可能尚未得到充分研究。最近的研究强调了免疫机制在白内障发展中的作用，不仅发现人类、小鼠和鸡的晶状体内存在驻留免疫细胞，还揭示了它们的...

作者贡献声明

周乐宇：研究设计、数据整理。陈伟：数据整理。关怀进：撰写、审稿与编辑、资金申请。李鹏飞：撰写初稿。钱晓曦：方法学设计、数据整理。季敏：撰写、审稿与编辑、资金申请。程晓：方法学设计、数据整理。戴玉鑫：数据整理。文梦琪：数据整理。严子豪：研究设计、数据整理

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突

数据和材料的可用性

本研究生成或分析的所有数据均包含在本文及其附加文件中。

伦理声明

本研究遵循《赫尔辛基宣言》的原则，并获得了南通大学附属医院伦理委员会的批准（编号2021-L091），动物实验的伦理批准号为P20250228-002。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（82171038）、江苏省研究医院（YJXYY202204）、江苏省医学重点学科（JSDW202245）、江苏省卫生健康委员会（M2021084）、南通市科技项目（MS22022020）和南通市卫生健康委员会（NTCXTD41）的资助。

利益冲突声明

所有作者均声明无相关利益冲突。

致谢

我们感谢所有参与者提供医学数据和晶状体标本以支持本研究。