《Nature Communications》：Endothelin-3 and T-type Ca2+ channels drive enteric neural crest cell calcium activity, contractility and migration
编辑推荐：
本研究旨在解决Hirschsprung病（HD）中肠道神经嵴细胞（ENCCs）迁移缺陷的机制问题。研究人员发现ENCCs的自发钙活性（CA）由EDN3/EDNRB信号通路通过氯通道和T型Ca2+通道（CaV3）介导，该活性驱动细胞收缩和迁移。抑制CA导致迁移缺陷，而激活CA则促进迁移。此研究揭示了EDN3在胚胎发育和成人血管收缩中的统一作用，为理解神经嵴病变提供了新视角。
在脊椎动物的胚胎发育过程中，有一群功能非凡的细胞——神经嵴细胞（Neural Crest Cells, NCCs），它们具有多向分化潜能和高度迁移能力，负责构建多种重要结构，包括颅面骨骼、肾上腺髓质的嗜铬细胞、周围神经系统的施万细胞，以及肠道神经系统（Enteric Nervous System, ENS）的神经元和胶质细胞。然而，当神经嵴细胞，特别是那些源自迷走神经区、负责形成肠道神经系统的肠道神经嵴细胞（Enteric Neural Crest Cells, ENCCs）的迁移过程出现异常时，就会导致一种称为赫什朋病（Hirschsprung disease, HD）的先天性疾病，即先天性巨结肠症。这种疾病是最常见的神经嵴病变（neurocristopathy）之一，大约每5000名新生儿中就有1例受累。
尽管已知胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）及其受体RET，以及内皮素-3（Endothelin-3, EDN3）及其受体EDNRB的信号通路突变与HD的发生有关，但这些已知的突变仅能解释部分家族性和散发性病例，大多数HD病例的病因至今仍未明确。此外，生物电活动，特别是钙离子（Ca2+）信号，在干细胞和神经嵴细胞行为调控中的作用日益受到关注。此前研究曾报道ENCCs中存在自发的、依赖嘌呤能信号传导的钙波，但这些钙波活动对于ENCC迁移以及HD的具体意义尚不清晰。因此，深入探究ENCCs中钙活动的特性、调控机制及其在细胞迁移中的功能，对于理解HD的发病机理和开发新的治疗策略至关重要。
在此背景下，由Nicolas R. Chevalier等人组成的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项重要研究，揭示了EDN3/EDNRB信号通路通过激活T型电压门控钙通道（T-type voltage-gated Ca2+channels, CaV3）来驱动ENCCs的钙活性，进而调控细胞收缩性和迁移能力的新机制。这项研究不仅将胚胎时期内皮素介导的神经嵴细胞迁移与成年期内皮素介导的血管平滑肌收缩这两个看似不相关的生理过程联系起来，还为理解包括HD在内的神经嵴病变提供了全新的视角，即从神经嵴细胞生物电活动缺陷的角度进行阐释。
为了开展这项研究，研究人员运用了几项关键的技术方法。他们利用转基因小鼠模型，使神经嵴细胞及其衍生物特异性表达钙离子荧光报告蛋白GCaMP6f，从而能够对胚胎肠道进行离体钙成像（Ca2+imaging），动态监测ENCCs的钙活动。通过自定义的图像分析流程，对钙瞬变（calcium transients）的空间分布和特征进行自动化定量分析。研究还结合了药理学方法，在离体培养的肠道组织或三维胶原凝胶中施加各种激动剂和拮抗剂，以特异性干预EDN3/EDNRB信号通路、不同类型的离子通道（如T型钙通道、氯通道等）以及细胞内钙库的释放，进而观察这些干预对ENCCs钙活性、迁移行为以及细胞对细胞外基质（extracellular matrix, ECM）牵引力（traction force）的影响。此外，免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）被用于确认特定蛋白（如Sox10, Tuj1, CaV3.1, CaV3.2, CaV3.3）在ENCCs中的表达和定位。对于无法表达GCaMP的疾病模型小鼠（Is/ls），研究采用荧光钙指示剂Fluo4-AM加载并结合体外培养来评估其ENCCs的钙活动。三维收缩力测定实验则通过追踪嵌入胶原凝胶中的荧光微珠的位移，来量化ENCCs施加于ECM的牵引力变化。
研究结果
肠道神经嵴细胞在肠道侵袭过程中表现出自发的Ca2+活性
研究人员通过离体培养特异性表达GCaMP6f的小鼠胚胎肠道，实时监测了ENCCs的钙活动。他们发现，迁移中的ENCCs存在自发的钙活性，且主要表现为异步的、非传播性的单细胞钙瞬变。虽然偶尔也能观察到径向传播到邻近细胞的钙波，但其发生频率（在E11.5阶段约为7.5x10-4次/分钟/100μm2）比单细胞事件低100-1000倍。ENCC迁移前沿的内源性钙活性从胚胎第10.5天（E10.5）到E12.5逐渐降低。在E11.5阶段，位于回盲连接处（ileo-cecal junction, ilcc）的ENCC波前的钙活性显著高于后方的ENCCs，并且集中在盲肠和回肠的系膜对侧缘。这种钙活性对河豚毒素（tetrodotoxin, TTX）不敏感，说明它并非源于神经活动。钙活性与ENCC特异性标志物Sox10共定位，但与神经元标志物Tuj1仅有部分共定位，表明自发性钙活性起源于ENCCs本身，并在肠道殖民早期最为活跃，随着ENCCs逐渐分化为神经元和胶质细胞而减弱。
内源性Ca2+活性由EDN3/EDNRB诱导
研究探讨了与ENCC发育相关的配体/受体对EDN3/EDNRB是否与ENCC的电活动有关。在E11.5肠道应用1 nM EDN3可使钙活性增加三倍，而在E12.5回肠应用10 nM EDN3可立即引起所有ENCCs细胞内钙离子的全面升高。相比之下，另一个重要的ENCC发育相关配体GDNF（10 ng/mL）则未改变钙活性。由于EDN3由肠道间充质细胞内生表达，且其表达模式（集中在盲肠和回肠系膜对侧缘）与观测到的钙活性热图高度吻合，研究人员使用EDNRB拮抗剂BQ788来阻断内源性EDN3/EDNRB信号。结果发现，BQ788几乎完全消除了钙活性（降低77±14%），并且这种抑制效应可持续至少24小时。此外，BQ788还导致ENCCs变圆和细胞突起的回缩。在HD模型小鼠（Is/ls，携带EDN3错义突变）中，ENCCs钙瞬变的平均频率比对照组低约25%。
T型Ca2+通道和Cl-通道介导Ca2+振荡
为了探究EDNRB下游导致钙振荡的离子转运机制，研究人员进行了系列药理学实验。移除细胞外钙离子（使用EDTA）可完全终止钙活性，而阳离子通道阻滞剂GdCl3也能显著降低钙活性。有趣的是，在EDTA存在下，急性给予10 nM EDN3仍能诱发钙瞬变，表明细胞内钙库也参与其中。IP3受体拮抗剂2-APB可中止钙活性，而兰尼碱受体（ryanodine receptor）拮抗剂兰尼碱则无影响，说明细胞外Ca2+和IP3敏感的细胞内钙库，而非兰尼碱敏感的钙库，共同贡献于钙活性。
进一步研究细胞外钙离子的进入途径，发现L型钙通道（CaV1.2）阻滞剂硝苯地平和P/Q型/N型钙通道（CaV2.1/CaV2.2）及TRPV通道的非选择性阻滞剂钌红均不影响钙活性。然而，使用Z944阻断所有三种T型钙通道（CaV3.1, CaV3.2, CaV3.3）可导致钙活性呈剂量和时间依赖性下降。特异性阻断CaV3.2（由Cacna1h基因编码）的抗坏血酸（ascorbic acid, AA）也产生类似效果。而T型钙通道激动剂SAK3（对CaV3.1和CaV3.3特异）在10μM浓度下能显著增加钙活性。免疫组化结果证实，CaV3.1、CaV3.2和CaV3.3三种通道类型均在ENCCs（Sox10阳性细胞）中表达，而在周围的间充质细胞中不表达。
针对氯通道的三种不同类型抑制剂（NPPB, NFA, DIDS）均能急剧降低钙活性并引起细胞突起回缩。氯通道可能通过氯离子外流引起细胞膜去极化，从而激活电压门控钙通道。这一观点与膜去极化剂4-AP能显著增加钙活性的现象一致。尽管嘌呤能通路（通过ATPe和ARL 67156）在EDNRB被阻断后能短暂增加钙波活动，甚至在高浓度ATPe下引起网络范围内的细胞内钙升高，但这些效应不能持久，表明嘌呤能通路无法绕过主要的调控者EDN3/EDNRB。
Ca2+活性与ENCC迁移速度相关
研究接下来探讨了药理学上调钙活性对ENCC迁移的影响。将E11.5中肠外植体包埋于三维胶原凝胶中培养，发现1 nM EDN3和10 ng/mL GDNF均能增加从外植体迁出的距离，且当两者联合应用时具有协同效应。值得注意的是，钙活性激活剂SAK3能够模拟EDN3的效果，即GDNF+SAK3 10μM条件下的迁移距离与GDNF+EDN3 1 nM条件下相似。
在非迁移许可性的琼脂糖凝胶中培养完整的E11.5肠道一天，评估钙活性抑制剂对结肠ENCC迁移的影响。发现四种能显著且持久降低钙活性的条件（Z944 50μM, NFA 50μM, AA 1 mM, BQ788 10μM）均减少了ENCC在结肠中的迁移距离。这些效应不能归因于药物毒性，因为在大多数样本中细胞死亡水平与对照组相当。在BQ788存在下加入SAK3并不能改善ENCC向结肠的迁移，这与该条件下钙活性仍然很低的结果一致。这些结果表明，除了已知的BQ788对ENCC迁移的抑制作用外，氯通道和T型电压门控钙通道的抑制也会导致迁移缺陷，引起结肠无神经节细胞症。
Ca2+活性驱动细胞收缩性和对细胞外基质的牵引力
多项观察表明，钙振荡可能通过影响细胞收缩性来调节ENCCs对组织的牵引力，类似于平滑肌的机制。首先，钙活性阻滞剂导致细胞突起回缩和细胞变圆，表明ENCC-ECM牵引力的丧失。其次，在二维迁移实验中，观察到钙瞬变可诱导板状伪足从基底突然脱离，这可能是由肌动球蛋白或钙蛋白酶（calpain）活性驱动。第三，大多数钙瞬变与细胞核速度的突然变化相关。
为了量化ENCCs施加于ECM的力，研究人员让ENCCs从E11.5中肠外植体迁移到植入荧光微珠（作为凝胶变形的基准标记）的胶原凝胶中。ENCCs对胶原支架的牵引力导致微珠向迁移前沿位移。在加入1 nM EDN3诱导钙活性后，微珠速度突然增加，迁移"指状"结构的尖端加速。当EDNRB被BQ788阻断时，微珠突然松弛，表明ENCC-ECM牵引力突然丧失，迁移指状结构回缩。T型钙通道阻滞剂Z944的效果与BQ788相似，尽管牵引力的下降程度较BQ788轻。该实验表明，与内皮素诱导的平滑肌收缩类似，EDN3能够刺激Ca2+依赖的肌动球蛋白活动，增加ENCC迁移所必需的ENCC-ECM牵引力；而阻断EDNRB或T型钙通道则使其松弛。
研究结论与意义
这项研究揭示了一个关键机制：内皮素-3（EDN3）通过其受体EDNRB，激活由氯通道和T型钙通道（CaV3）介导的钙活性，从而驱动肠道神经嵴细胞（ENCCs）的收缩和迁移。这种机制与内皮素在成人血管平滑肌中引起收缩的机制高度相似，将胚胎发育中的细胞迁移事件与成体生理功能联系起来，提供了一个统一的解释框架。
研究的意义重大。首先，它深化了对赫什朋病（HD）发病机制的理解，指出除了已知的GDNF/RET和EDN3/EDNRB通路突变外，任何破坏该钙信号机制组成部分（包括T型钙通道，如CaV3.2）的因素都可能导致ENCC迁移缺陷，从而引发HD。这为寻找新的HD致病基因和风险因素指明了方向，特别是近期全外显子组关联研究发现的CACNA1H（编码CaV3.2）基因单核苷酸多态性（SNP）与HD的关联，在此研究中找到了功能上的支持。其次，该研究提出了从神经嵴细胞生物电活动缺陷角度理解神经嵴病变（neurocristopathies）的新范式，这可能适用于其他源于神经嵴的细胞类型（如黑色素细胞、施万细胞）及其相关疾病。第三，鉴于神经嵴发育程序在癌症（如黑色素瘤、神经母细胞瘤）侵袭和转移中的重演，以及内皮素轴和T型钙通道在多种肿瘤中的异常表达，本研究揭示的细胞迁移机制可能也适用于解释癌细胞的侵袭行为，为癌症研究提供了新的视角。
总之，这项研究不仅解决了发育生物学领域的一个关键问题，而且其发现具有广泛的生物学和医学意义，为未来针对神经嵴相关疾病和癌症的治疗策略开发奠定了重要的理论基础。
