鹦鹉热衣原体包涵体膜蛋白CPSIT_0844通过TLR2/TLR4-MyD88信号轴激活MAPK/NF-κB通路诱导人单核细胞炎症因子IL-6与IL-8产生的机制研究

《Immunobiology》：Chlamydia psittaci inclusion membrane protein CPSIT_0844 elicits inflammatory IL-6 and IL-8 production in human monocytes via TLR2/TLR4 signaling pathways

本研究聚焦于鹦鹉热衣原体（C. psittaci）感染引发的严重炎症反应，旨在阐明其包涵体膜蛋白CPSIT_0844的致炎机制。研究人员发现CPSIT_0844能通过TLR2/TLR4-MyD88依赖性信号通路，激活p38/JNK MAPK及NF-κB通路，进而驱动人单核细胞THP-1产生关键炎症因子IL-6和IL-8。该研究为揭示鹦鹉热衣原体的致病机理及开发针对性抗炎策略提供了重要分子依据。

　　

鹦鹉热，一种由鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci, C. psittaci）引起的人畜共患疾病，常表现为严重的呼吸道感染，如社区获得性肺炎，甚至可危及生命并伴有多种器官受累。除了急性感染，鹦鹉热衣原体还能建立慢性感染，构成持续的公共卫生威胁。这类严重临床表现的发病机制与宿主过度的炎症反应密切相关，然而，驱动这种免疫病理的确切细菌因子尚未完全阐明。鹦鹉热衣原体作为一种专性细胞内寄生菌，其III型分泌系统（Type III Secretion System, T3SS）是关键的毒力机制，能将效应蛋白直接注入宿主细胞质。其中，包涵体膜蛋白（Inclusion membrane proteins, Incs）在病原体与宿主相互作用中扮演着桥梁角色。尽管已知其他衣原体物种的某些膜蛋白或效应蛋白能触发宿主炎症因子分泌，但鹦鹉热衣原体特异性包涵体膜蛋白，尤其是CPSIT_0844，在驱动炎症反应中的具体作用和机制仍不清楚。前期研究发现CPSIT_0844能刺激人单核细胞系THP-1分泌炎症细胞因子，提示其可能在鹦鹉热衣原体致病性及炎症病理损伤中具有重要作用。

为深入揭示CPSIT_0844的致炎机制，研究人员开展了一系列实验。本研究主要运用了以下关键技术方法：利用THP-1人单核细胞系进行体外刺激实验；通过小干扰RNA（siRNA）技术敲低Toll样受体2/4/6（TLR2/TLR4/TLR6）基因表达；使用显性负性髓样分化因子88（dominant negative MyD88, DN-MyD88）质粒转染抑制MyD88功能；采用蛋白质印迹法（Western blot）分析信号通路蛋白磷酸化水平；通过免疫荧光染色观察核因子κB（NF-κB） p65亚基的核转位；并利用酶联免疫吸附测定（ELISA）和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测炎症因子白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素8（IL-8）的表达与分泌。

3.1. CPSIT_0844 induces dose- and time-dependent expression of IL-6 and IL-8 in THP-1 cells

研究结果显示，纯化的CPSIT_0844蛋白能以剂量依赖性和时间依赖性的方式诱导THP-1细胞中IL-6和IL-8的mRNA和蛋白表达水平升高。在测试的浓度范围（2–10 μg/mL）内，4 μg/mL的CPSIT_0844能引发最强烈的反应。峰值mRNA水平出现在刺激后12小时，而最大蛋白分泌量则在24小时检测到。这表明CPSIT_0844能有效诱导THP-1单核细胞产生IL-6和IL-8。

3.2. TLR2 and TLR4 mediate the proinflammatory response to CPSIT_0844

研究发现，CPSIT_0844刺激能上调THP-1细胞中TLR2和TLR4的表达。通过siRNA分别敲低TLR2或TLR4后，CPSIT_0844诱导的IL-6和IL-8产生均显著减弱。这表明TLR2和TLR4共同介导了CPSIT_0844的促炎反应。

3.3. MyD88 is required for CPSIT_0844-induced cytokine production

CPSIT_0844处理增加了THP-1细胞中髓样分化因子88（MyD88）的表达。当使用DN-MyD88质粒抑制MyD88信号后，CPSIT_0844刺激引发的IL-6和IL-8的mRNA和蛋白水平均被显著抑制。这证明CPSIT_0844触发的促炎信号依赖于接头蛋白MyD88。

3.4. CPSIT_0844 activates the p38 and JNK/MAPK pathways to drive cytokine expression

蛋白质印迹分析显示，CPSIT_0844诱导了p38和JNK的磷酸化，但未激活ERK。p38磷酸化在30分钟达到峰值，而JNK磷酸化在120分钟达到峰值。敲低TLR2或TLR4，或抑制MyD88，均能抑制p38和JNK的磷酸化。使用p38或JNK的特异性抑制剂预处理，能显著减少IL-6和IL-8的产生，而ERK抑制剂则无此效果。这表明p38和JNK/MAPK通路被CPSIT_0844特异性激活，并且是细胞因子诱导所必需的。

3.5. CPSIT_0844 activates the NF-κB signaling pathway

CPSIT_0844在30分钟内迅速诱导了IκBα的磷酸化和降解，这是NF-κB激活的标志。此激活同样依赖于上游的TLR2/TLR4-MyD88轴。使用NF-κB抑制剂BAY11-7082能显著降低CPSIT_0844诱导的IL-6和IL-8表达。免疫荧光分析进一步证实，CPSIT_0844刺激能促进NF-κB p65亚基从细胞质向细胞核转位，而此过程可被BAY11-7082阻断。这些结果证明NF-κB信号通路在CPSIT_0844引发的炎症反应中起着关键作用。

综上所述，本研究阐明了一条完整的信号通路：鹦鹉热衣原体效应蛋白CPSIT_0844通过TLR2和TLR4被识别，进而招募关键接头蛋白MyD88，依次激活p38/JNK MAPK信号通路和NF-κB信号通路，最终导致促炎细胞因子IL-6和IL-8的转录和分泌。这一发现不仅深化了对鹦鹉热衣原体感染炎症发病机制的理解，特别是明确了包涵体膜蛋白作为重要毒力因子直接参与触发宿主炎症级联反应，也为针对特定炎症通路干预衣原体疾病提供了潜在的理论基础和新的治疗靶点思路。该研究完整揭示了CPSIT_0844作为前炎性毒力因子在宿主-病原体相互作用中的关键角色，对理解鹦鹉热的免疫病理及开发抗炎策略具有重要意义。本研究发表于《Immunobiology》。