长链非编码RNA 4632427E13Rik通过miR-34a-5p/Aldoa/Hif-1α通路调控缺氧条件下颌骨来源间充质干细胞成骨与血管生成的作用及机制研究

《International Dental Journal》：4632427E13Rik Facilitates Jaw Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Osteogenesis and Angiogenesis Under Hypoxia Through miR-34a-5p/Aldoa/Hif-1α Pathway

本研究针对颌面骨缺损修复的临床难题，探讨了缺氧预处理对颌骨骨髓间充质干细胞(JMMSCs)成骨与血管生成能力的增强作用。研究人员发现lncRNA 4632427E13Rik在缺氧条件下显著上调，并通过海绵吸附miR-34a-5p激活Aldoa/ERK/Hif-1α信号轴，从而显著提升JMMSCs的骨再生能力。该研究为颌面骨再生提供了新的治疗靶点和策略。

　　

颌面骨缺损的修复与再生一直是口腔颌面外科和再生医学领域面临的重大挑战。这些缺损可能源于先天畸形、创伤、肿瘤或感染，常常导致骨不连，严重影响患者的咀嚼功能、面部美观甚至心理健康。尽管间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)在组织工程和再生医学中展现出巨大潜力，但移植后干细胞存活率低、恶劣的局部微环境（如活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)水平升高、细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)支持不足）严重限制了其治疗效果。颌骨骨髓来源的间充质干细胞(Jaw Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells, JMMSCs)因其与颌面骨组织具有相同的胚胎起源（均来源于外胚层），表现出更优的组织相容性、强大的增殖和多向分化潜能，以及在应激条件下的良好存活能力，被认为是修复颌面骨缺损的理想种子细胞。然而，如何有效提升JMMSCs在移植后的存活率和功能，是推动其临床应用的关键。

值得注意的是，体内的MSCs通常存在于生理性低氧微环境（1%-5% O₂）中，而常规的体外培养则在常氧（约20% O₂）条件下进行，这种差异可能影响干细胞的生物学特性。缺氧预处理已被证明是一种增强MSCs抵抗移植后恶劣微环境、抑制细胞凋亡的有效策略。但缺氧调控JMMSCs成骨和血管生成的具体分子机制尚不明确。为了解决这一问题，发表在《International Dental Journal》上的这项研究深入探讨了缺氧预处理增强JMMSCs功能的背后机制。

研究人员综合运用了细胞模型、小鼠颅骨缺损模型以及多种分子生物学技术。关键实验技术包括：从2周龄C57BL/6N小鼠分离培养JMMSCs和骨髓间充质干细胞(Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells, BMMSCs)作为对照；使用氯化钴(Cobalt Chloride, CoCl₂)模拟体外缺氧条件；通过微阵列分析筛选缺氧条件下差异表达的长链非编码RNA(Long Non-coding RNA, lncRNA)；利用RNA干扰技术（小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)）敲低目标基因表达（lnc-4632427E13Rik和Aldoa）；通过荧光素酶报告基因实验验证lncRNA与microRNA (miRNA)之间的直接相互作用；采用定量实时聚合酶链式反应(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR)和蛋白质印迹(Western Blot)检测基因和蛋白表达水平；通过碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)染色和茜素红S(Alizarin Red S, ARS)染色评估体外成骨分化能力；通过细胞划痕实验和体外成管实验评估细胞迁移和血管生成能力；建立小鼠颅骨临界尺寸缺损模型，并通过微型电子计算机断层扫描(Micro-Computed Tomography, micro-CT)和组织学分析（苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin, H&E)染色、免疫组织化学染色）评估体内骨再生效果。

JMMSCs以及BMMSCs植入促进骨缺损修复

研究人员首先比较了JMMSCs和BMMSCs在修复小鼠颅骨（额骨和顶骨）缺损方面的能力。Micro-CT扫描和三维重建分析显示，在植入8周后，两种细胞均能促进新骨形成。定量分析表明，在骨量参数（骨体积分数(Bone Volume/Total Volume, BV/TV)和骨表面密度(Bone Surface/Total Volume, BS/TV)）上两组无显著差异，但在骨质量参数（骨小梁数量(Trabecular Number, Tb.N)和骨小梁分离度(Trabecular Separation, Tb.Sp)）上，JMMSCs在修复额骨（同源于外胚层）时表现出优势，而BMMSCs在修复顶骨（同源于中胚层）时效果更好，提示同源组织来源的干细胞可能具有更好的修复效能。

缺氧预处理增强JMMSCs的体外成骨能力

为了研究缺氧对JMMSCs的影响，研究人员使用CoCl₂建立体外缺氧模型。通过剂量筛选，确定50 μM CoCl₂能显著增强JMMSCs的迁移能力，并通过细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8, CCK-8)实验和Ki67免疫荧光染色证实该浓度能促进细胞增殖。Hif-1α表达的显著上调证实了缺氧模型建立成功。将JMMSCs进行不同时长（1、3、5、7天）的缺氧预处理后，再置于成骨诱导培养基中培养7天。qRT-PCR和Western Blot结果显示，缺氧预处理（特别是3天和5天）显著上调了关键成骨标志物（Runt相关转录因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(Alp)、骨钙素(Osteocalcin, Ocn)）的表达。ALP染色和ARS染色也显示缺氧预处理组的矿化结节形成明显增加，表明其成骨分化能力增强。

缺氧预处理增强JMMSCs的体外血管生成能力

研究人员收集了经不同时长缺氧预处理的JMMSCs的条件培养基(Conditioned Medium, CM)，并用其处理小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3)。qRT-PCR分析显示，用缺氧预处理3天的JMMSCs条件培养基(H3-CM)处理的bEnd.3细胞，其血管生成相关标志物（血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, Vegf)和CD31）表达显著升高。在基质胶(Matrigel)成管实验中，H1-CM和H3-CM处理组形成的管状结构分支点和连接点数量明显多于其他组，Vegf的免疫荧光染色强度也最强。这些结果证实缺氧预处理能增强JMMSCs的旁分泌作用，进而促进血管生成。

缺氧预处理在体内促进JMMSCs的成骨和血管生成

为了验证体内效果，研究人员将经过缺氧或常氧预处理的JMMSCs负载到基质胶上，植入小鼠颅骨缺损处。在植入后4周和8周，Micro-CT分析显示，缺氧预处理组的新骨形成量（BV/TV）、骨表面密度（BS/TV）和骨小梁数量（Tb.N）均显著高于常氧预处理组。组织学分析（免疫组织化学染色）进一步显示，缺氧预处理组缺损区域的成骨标志物（Runx2、Alp、Ocn）和血管生成标志物（Vegf、CD31）表达更强，并且观察到更多的骨样结构，表明缺氧预处理能显著促进JMMSCs在体内的成骨和血管生成。

Lnc-4632427E13Rik在缺氧预处理下显著诱导，并促进JMMSCs的成骨和血管生成

为了阐明缺氧作用的分子机制，研究人员对缺氧和常氧条件下的JMMSCs进行了lncRNA微阵列分析。结果显示，lnc-4632427E13Rik是缺氧条件下上调最显著的lncRNA。生物信息学预测其定位于细胞质。qRT-PCR验证了其在缺氧JMMSCs及其条件培养基处理的bEnd.3细胞中表达上调。通过siRNA敲低lnc-4632427E13Rik后，缺氧预处理所增强的成骨分化（ALP和ARS染色减弱，成骨标志物表达下降）和促血管生成作用（Vegf、CD31表达降低，成管能力减弱）均被部分逆转，表明lnc-4632427E13Rik在调控JMMSCs功能中起关键作用。

Lnc-4632427E13Rik通过抑制miR-34a-5p来调控Aldoa表达

基于竞争性内源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)假说，研究人员推测lnc-4632427E13Rik可能通过吸附miRNA发挥作用。利用LncBase和starBase等数据库进行生物信息学分析，预测并构建了lncRNA-miRNA-mRNA调控网络，发现lnc-4632427E13Rik与miR-34a-5p存在互补结合位点，而miR-34a-5p可靶向Aldoa的3'非翻译区(3' Untranslated Region, 3'UTR)。实验验证发现，缺氧条件下，miR-34a-5p表达下调，而Aldoa（果糖二磷酸醛缩酶A）的mRNA和蛋白水平均上调。敲低lnc-4632427E13Rik会导致miR-34a-5p表达回升而Aldoa表达下降。荧光素酶报告基因实验进一步证实，miR-34a-5p可直接与lnc-4632427E13Rik以及Aldoa的3'UTR野生型序列结合，从而抑制报告基因活性，而突变结合位点后此抑制效应消失。这些结果证实了lnc-4632427E13Rik/miR-34a-5p/Aldoa这一ceRNA调控轴的存在。

Lnc-4632427E13Rik通过Aldoa/ERK/Hif-1α信号通路在体外促进JMMSCs的成骨和血管生成

接下来，研究人员探讨了Aldoa的下游信号通路。敲低Aldoa同样逆转了缺氧预处理对JMMSCs成骨分化和促血管生成能力的增强作用。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析提示Hif-1信号通路可能参与其中。已知缺氧可激活MAPK通路中的细胞外信号调节激酶(Extracellular Signal-regulated Kinase, ERK)。Western Blot结果显示，缺氧条件下磷酸化ERK(p-ERK)和Hif-1α蛋白水平升高，而敲低Aldoa后，p-ERK和Hif-1α的表达均下降，但c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal Kinase, JNK)和p38的磷酸化水平无显著变化。这表明Aldoa主要通过激活ERK/Hif-1α信号轴来发挥其促进成骨和血管生成的作用。

本研究得出结论：缺氧预处理能显著增强JMMSCs的成骨和血管生成潜能。其分子机制在于缺氧诱导lnc-4632427E13Rik表达上调，后者作为分子海绵竞争性结合miR-34a-5p，解除miR-34a-5p对Aldoa的抑制，进而激活ERK/Hif-1α信号通路，最终协同促进JMMSCs的骨再生功能。

在讨论部分，作者强调了本研究的创新性和意义。首先，研究结果支持了“同源修复”的优势，即来源于相同胚层的干细胞（如外胚层来源的JMMSCs修复额骨）可能更具优势，这为选择颌面骨修复的种子细胞提供了新思路。其次，本研究首次揭示了一条新的ceRNA调控轴（lnc-4632427E13Rik/miR-34a-5p/Aldoa）在缺氧调控JMMSCs功能中的核心作用，深化了对非编码RNA在骨代谢中调控机制的认识。最后，研究明确了Aldoa/ERK/Hif-1α是该过程的关键下游信号通路，将代谢酶Aldoa的功能与干细胞成骨分化联系起来，拓宽了对其功能的理解。

当然，研究也存在一些局限性，例如使用的CoCl₂化学模拟缺氧与生理性缺氧可能存在差异，以及小鼠颅骨缺损模型不能完全模拟人类颌面骨的复杂环境。尽管如此，这项研究为利用缺氧预处理和靶向特定lncRNA/miRNA轴来优化干细胞疗法、提高颌面骨缺损修复效果提供了重要的理论依据和潜在的治疗靶点，具有重要的临床转化前景。