《Current Microbiology》：Candida Tropicalis Biofilm Formation Under Secondary Bile Salt Sodium Deoxycholate
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本研究针对肠道中次级胆汁盐如何影响非白念珠菌物种的致病性这一空白，系统探讨了脱氧胆酸钠(NaDCA)对热带念珠菌生物膜形成、形态结构及毒力基因表达的影响。研究发现，与白念珠菌不同，热带念珠菌能在生理相关浓度(0.1%)的NaDCA下维持生物膜生物量和表面疏水性，其毒力因子基因(ALS、ECE1)表达未受显著抑制，且铁代谢相关基因发生重编程。该研究揭示了两种念珠菌在肠道胆汁盐环境下的适应性差异，为理解其生态位分布及致病机制提供了新视角。
在我们每个人的肠道中，都存在着一个复杂而动态的微生物社会，其中就包括念珠菌属的真菌。它们通常是和平的定居者，但在人体免疫力下降时，却能摇身一变，成为引发严重甚至致命系统性感染的“机会主义者”。长期以来，医学界对最常见的白念珠菌研究较为深入，然而近年来，非白念珠菌物种，尤其是热带念珠菌，引起的感染病例正悄然增加，被世界卫生组织列为高优先级病原体。肠道内的念珠菌无时无刻不暴露在细菌代谢产物中，次级胆汁盐便是其中一类关键分子。它们由肠道共生细菌产生，不仅辅助脂质吸收，还对其他微生物产生深远影响。先前研究表明，次级胆汁盐能抑制白念珠菌的菌丝形成和生物膜构建，从而可能削弱其致病力。但一个关键问题悬而未决：作为重要病原体的热带念珠菌，在面对相同的胆汁盐环境时，会作何反应？它们与白念珠菌的生存策略有何不同？这直接关系到我们理解不同念珠菌物种如何在肠道这一共同战场上占据各自的生态位。
为了回答这些问题，由Takahiro Namiki等研究人员在《Current Microbiology》上发表的研究，对次级胆汁盐脱氧胆酸钠如何影响热带念珠菌的生物膜展开了系统性的探索。研究人员采用了一种多技术路径的研究策略。他们首先利用晶体紫染色法定量评估了NaDCA对多种热带念珠菌临床分离株及标准菌株生物膜生物量的影响，并与白念珠菌进行对比。通过光学显微镜和荧光显微镜（包括3D成像技术）详细观察了生物膜的形态结构变化。表面疏水性则通过碳氢化合物粘附法进行测定。为了深入分子机制，研究团队采用了RNA测序技术全面分析了NaDCA处理下热带念珠菌的转录组变化，并通过实时荧光定量PCR对关键毒力因子基因（如ALS家族基因和ECE1）的表达进行了靶向验证。此外，还设计了铁补充实验，探讨了铁可用性对生物膜形成的影响。研究所用的热带念珠菌菌株包括来自资源中心的标准菌株和来自医院血培养的临床分离株。
C. Tropicalis Biofilms Were Better Maintained than C. Albicans Biofilms in the Presence of NaDCA
研究人员通过晶体紫染色法发现，白念珠菌JCM1542的生物膜生物量随着NaDCA浓度升高而显著减少。相反，所测试的五株热带念珠菌中，多数菌株在高达0.1%的NaDCA浓度下，其生物膜生物量并未受到抑制，甚至部分菌株（如JCM1541、A和1822）的生物量还有所增加。只有在高浓度(0.5%) NaDCA下，部分热带念珠菌菌株（8号和1712号）的生物膜才出现下降，表现出菌株依赖性。形态学观察显示，未经NaDCA处理时，白念珠菌和热带念珠菌均能在培养板底部形成均匀分布的菌丝网络。然而，在NaDCA存在下，白念珠菌的附着稀疏，菌丝稀少，而热带念珠菌则形成斑块状的小型酵母/菌丝聚集体，呈现颗粒状外观。成熟的生物膜荧光显微镜成像进一步揭示，NaDCA处理使白念珠菌几乎丧失了向上的菌丝投射，而热带念珠菌的菌丝投射虽变短，导致生物膜最大厚度减少，但整体结构保持相对完整。
NaDCA Causes Shortening of Filaments in C. Tropicalis as Well as C. Albicans, but neither Filamentation Per Se nor Surface Hydrophobicity Was Reduced in C. Tropicalis, Unlike in C. Albicans
为了更精细地观察NaDCA对菌丝形成的影响，研究人员进行了时序观察。结果显示，NaDCA处理导致白念珠菌和热带念珠菌的菌丝最大长度在诱导3小时后均显著缩短。然而，就菌丝形成率（形成菌丝的细胞百分比）而言，NaDCA仅在白念珠菌JCM1542和热带念珠菌1822株中引起了显著抑制，对其他热带念珠菌菌株的影响不显著，表明白丝延长和菌丝形成本身可能受不同机制调控。表面疏水性是微生物附着和生物膜形成的关键物理属性。研究发现，NaDCA处理使白念珠菌的表面疏水性从57.8%大幅降至23.4%。与之形成鲜明对比的是，热带念珠菌菌株的表面疏水性并未出现一致性降低，甚至有两株菌（A和1712）的表面疏水性在NaDCA处理后反而升高。这解释了为何热带念珠菌在胆汁盐存在下仍能维持较强的表面附着和生物膜聚集能力。
NaDCA Altered the Expression of Multiple Genes
为了从分子层面揭示热带念珠菌对NaDCA的应答机制，研究人员进行了RNA-seq转录组分析。分析结果显示，NaDCA处理引起了62个基因表达发生显著变化（log2倍变化>0.6）。尤为突出的是，多个与铁代谢相关的基因表达下调，包括铁氧化还原酶结构域蛋白、铁转运多铜氧化酶FET3、铁转运蛋白FTH1、铁螯合还原酶（NADPH）以及质膜铁透酶等。同时，一些与细胞壁合成（如几丁质酶、甾醇24-C-甲基转移酶ERG6）、细胞膜合成（如磷脂酰合酶）及细胞内膜运输相关的基因表达上调。基因本体论分析进一步证实，差异表达基因显著富集于铁离子稳态、铁离子转运、过渡金属离子转运等生物学过程，以及作用于金属离子的氧化还原酶活性、铁螯合还原酶活性等分子功能。尽管转录组发生了广泛变化，但一些已知的与形态转变（如ADH1, BCR1, EFG1, TEC1, UME6）、药物外排（如CDR1, MDR1）、应激反应、水解酶及细胞壁合成相关的关键基因表达并未发生显著改变。值得注意的是，RNA-seq未能有效检测到凝集素样序列基因（ALST1-3）和白念珠菌ECE1的表达。因此，研究人员通过RT-qPCR进行了靶向验证。结果显示，在白念珠菌中，NaDCA导致ALS1表达上调346%，但ALS3和ECE1表达分别被抑制92.2%和99.2%。而在热带念珠菌中，ALST1表达普遍上调（除JCM1541外），ALST2和ALST3表达未受抑制甚至部分上调（如菌株8的ALST3）。ECE1的表达在热带念珠菌中各菌株反应不一，未观察到一致的抑制或上调模式。这表明，关键毒力因子基因表达的差异调控可能是两种念珠菌对NaDCA反应不同的重要原因。
Some C. Tropicalls Strains Treated with NaDCA Are Sensitive To Iron Overload
鉴于RNA-seq结果提示铁代谢重编程，研究人员进一步探讨了铁可用性对生物膜形成的影响。他们发现在未处理NaDCA的热带念珠菌中，铁负载（10, 50, 250 μg/dL FeSO4）对生物膜生物量的影响因菌株而异，部分菌株呈现先增后降的趋势。然而，在NaDCA存在的情况下，热带念珠菌菌株8、1712和1822的生物膜生物量随着铁浓度的增加而显著下降。相反，白念珠菌的生物膜生物量在不同铁负载下均无显著变化。这表明，处于NaDCA环境下的部分热带念珠菌菌株对铁过载引起的氧化应激可能更为敏感，其下调铁获取基因的表达可能是一种适应性反应，以避免铁毒性。
本研究得出结论：与白念珠菌相比，热带念珠菌的生物膜对次级胆汁盐NaDCA具有更强的耐受性。NaDCA虽能引起两种念珠菌菌丝缩短，但仅对白念珠菌的表面疏水性和关键毒力因子基因（ALS3, ECE1）表达产生强烈抑制，而热带念珠菌则能维持其表面特性，且其ALS基因和ECE1表达未受同等程度的抑制。转录组分析揭示了NaDCA处理下热带念珠菌铁代谢相关基因的广泛下调，并且部分菌株在NaDCA存在时对高铁环境表现出敏感性。这些发现具有重要意义，它们强烈提示白念珠菌和热带念珠菌在肠道中可能占据不同的生态位，其适应策略受到局部次级胆汁盐浓度和铁可用性的影响。热带念珠菌对肠道较高胆汁盐环境的适应性可能使其在特定肠段具有竞争优势。此外，研究还提示口服铁摄入量可能通过影响氧化应激水平来调节肠道内热带念珠菌的负荷。该研究不仅增进了我们对非白念珠菌物种致病机制的理解，也为探索通过调节肠道微环境（如胆汁盐谱、铁水平）来控制念珠菌定植和感染提供了新的思路。当然，研究的局限性，如体外模型与体内复杂环境的差异、其他胆汁盐的作用、菌株间差异的具体遗传基础等，仍是未来需要深入探索的方向。
