《Human Cell》：Ethambutol induces optic neuropathy through SDHB-mediated ferroptosis in retinal ganglion cells via Smad4 pathway
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本研究针对抗结核药物乙胺丁醇(EMB)诱发视神经病变(EON)的临床难题，通过体内外实验首次揭示EMB通过抑制转录因子Smad4与SDHB启动子结合，下调线粒体复合体II关键亚基SDHB表达，进而诱发视网膜神经节细胞铁死亡的新机制。研究发现不仅阐明了EON的病理机制，更为临床防治提供了SDHB和Smad4等重要靶点。
在结核病治疗领域，乙胺丁醇(EMB)作为一线抗结核药物发挥着重要作用，然而其严重的视神经毒性副作用——乙胺丁醇诱导的视神经病变(EON)却给患者带来不可逆的视力损害。临床上，EON通常表现为视力模糊、色觉异常和中心暗点等症状，且具有时间和剂量依赖性特点。更令人担忧的是，由于缺乏早期客观诊断指标，EON往往被发现时已造成不可逆损伤。尽管停药后部分患者视力可能恢复，但相当比例患者会遭受永久性视力丧失，这迫切需要我们深入探索EON的发病机制。
以往研究多集中于EON的临床表现，对其分子机制了解甚少。已知氧化应激和线粒体功能障碍在神经退行性疾病中扮演重要角色，但EMB如何具体损伤视网膜神经节细胞(RGCs)的确切机制仍不明确。铁死亡作为一种新发现的程序性细胞死亡方式，以铁依赖的脂质过氧化物积累为特征，在多种神经退行性疾病中被证实参与神经元损伤过程。然而，铁死亡是否参与EON的发生发展，以及其具体调控机制如何，均有待阐明。
针对这一科学问题，杭州红十字会医院李秋实、葛伟等研究人员在《Human Cell》杂志上发表了一项创新性研究，系统揭示了EMB通过Smad4/SDHB通路诱导视网膜神经节细胞铁死亡的分子机制。研究人员首先通过建立EON大鼠模型，证实EMB处理可导致视网膜神经节细胞层结构损伤和细胞丢失。体外实验发现，EMB对RGC-5细胞具有剂量和时间依赖性毒性作用，且铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)能最有效逆转EMB引起的细胞死亡，提示铁死亡是EMB诱导RGC死亡的主要方式。
为验证铁死亡参与，研究团队通过流式细胞术检测到EMB处理后细胞内活性氧(ROS)和脂质ROS水平显著升高。Western blot结果显示，铁死亡关键负调控因子SLC7A11和GPX4表达下调，同时谷胱甘肽(GSH)水平下降，而丙二醛(MDA)和4-羟基壬烯醛(4-HNE)水平上升，这些典型铁死亡标志物的变化进一步证实了铁死亡的激活。
通过高通量测序分析，研究人员发现EMB处理引起差异表达基因主要富集于氧化磷酸化等代谢通路。特别值得注意的是，线粒体复合体II关键亚基琥珀酸脱氢酶B(SDHB)表达显著下调。后续实验证实，沉默SDHB可导致SLC7A11和GPX4表达降低，ROS水平升高，细胞活力下降，模拟了EMB处理的表现。而过表达SDHB则能部分逆转EMB诱导的铁死亡，表明SDHB在EMB神经毒性中的核心作用。
机制探索方面，研究发现EMB能显著抑制转录因子Smad4的磷酸化水平。生物信息学预测和实验验证表明，Smad4能直接结合SDHB启动子区域并调控其转录。双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀(CHIP)证实，EMB通过抑制Smad4与SDHB启动子的结合，从而下调SDHB表达。救援实验进一步证明，Smad4敲低可逆转SDHB过表达对铁死亡的保护作用，确立了Smad4在SDHB上游的调控地位。
本研究采用的主要技术方法包括：通过体内动物模型（Wistar大鼠）和体外细胞模型（RGC-5细胞）模拟EON；MTT法检测细胞活力；流式细胞术分析ROS水平；Western blot检测蛋白表达；酶联免疫吸附测定(ELISA)检测铁死亡标志物；高通量测序分析差异表达基因；双荧光素酶报告基因和CHIP实验验证转录调控关系。
EMB诱导视神经病变通过铁死亡介导的机制
研究团队通过组织染色显示EMB处理导致大鼠视网膜神经节细胞层结构损伤和细胞丢失。体外实验确定EMB对RGC-5细胞的半数抑制浓度(IC50)，并通过特异性细胞死亡抑制剂证实铁死亡是主要死亡方式。
EMB通过抑制SDHB表达损伤RGCs
转录组分析发现EMB引起多个线粒体电子传递链组分基因下调，其中SDHB变化最为显著。实验验证表明EMB在mRNA和蛋白水平均抑制SDHB表达。
SDHB负调控EMB诱导的RGCs铁死亡
基因沉默实验证明SDHB缺失可导致铁死亡关键蛋白表达改变、ROS水平升高和细胞活力下降。恢复实验显示过表达SDHB能部分逆转EMB诱导的铁死亡表型。
EMB通过抑制Smad4-SDHB相互作用调控SDHB转录活性
机制研究发现EMB抑制转录因子Smad4表达，后者可直接结合SDHB启动子并调控其转录。EMB处理破坏Smad4与SDHB启动子的结合，从而抑制SDHB转录。
本研究首次系统阐明EMB通过Smad4/SDHB轴诱导视网膜神经节细胞铁死亡的分子通路，不仅深化了对EON发病机制的认识，也为临床防治提供了新的潜在靶点。研究发现铁死亡是EMB神经毒性的关键执行方式，而SDHB作为连接线粒体功能障碍与铁死亡的核心分子，其表达受转录因子Smad4直接调控。这一机制的揭示为开发早期诊断生物标志物和靶向治疗策略奠定了理论基础，对保障结核病患者用药安全具有重要意义。
研究同时指出，除铁死亡外，细胞焦亡也可能参与EMB诱导的RGC死亡，提示EON中可能存在多种细胞死亡方式的交叉对话。未来研究需在更接近生理条件的模型中对这一通路进行验证，并探索针对该通路的特异性干预措施，为临床转化提供更多依据。
