《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：A cross-correction gene therapy approach for CDKL5 deficiency disorder improves the pathological phenotype of CDD patient-derived cortical organoids
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本研究开发了一种基于可分泌性细胞穿透肽TATk的CDKL5融合蛋白（Igk-TATk-CDKL5）基因疗法。通过在CDKL5缺乏症（CDD）患者来源的皮质类器官模型中验证，该疗法相比传统CDKL5蛋白递送能更有效地恢复神经元增殖、减少细胞凋亡，并部分改善网络异常放电，为治疗这一严重神经发育障碍提供了新策略。
引言
CDKL5缺乏症（CDD）是一种由CDKL5基因突变引起的严重神经发育障碍，其特征为早发性癫痫、严重智力残疾及运动视觉功能受损。尽管小鼠模型在研究CDD机制中发挥了作用，但其无法完全模拟人类疾病的早期癫痫发作特征。近年来，人多能干细胞（iPSCs）衍生的三维皮质类器官为在体外模拟人类神经发育和研究CDD病理机制提供了新平台。本研究团队前期开发了一种基于可分泌性细胞穿透肽TATk的CDKL5融合蛋白（Igk-TATk-CDKL5）的基因疗法，并在CDD小鼠模型中显示出良好的脑内分布和治疗效果。本研究旨在利用CDD患者来源的皮质类器官这一人源化模型，比较该新型交叉校正基因疗法与传统CDKL5蛋白疗法的疗效。
材料与方法
研究使用了两株携带CDKL5无义突变（R59X）的CDD患者来源iPSC系及其同源健康对照系，通过已建立的protocol生成皮质类器官。为评估基因疗法，研究采用AAVPHP.B病毒载体分别递送Igk-TATk-CDKL5（实验组）或野生型CDKL5（对照组）的编码基因。通过免疫荧光染色、蛋白质印迹（Western blot）分析CDKL5蛋白表达及其下游底物EB2的磷酸化水平。利用微电极阵列（MEA）记录类器官的神经元网络电活动，以评估其兴奋性和同步性。通过免疫标记检测细胞增殖标志物（Ki-67, PCNA）和细胞凋亡标志物（Cleaved Caspase-3），并分析神经元标志物（NeuN, MAP2）的表达，以评估治疗对细胞表型的影响。
结果
AAV转导效率与CDKL5蛋白恢复
剂量探索实验表明，AAVPHP.B能有效转导皮质类器官，且CDKL5表达呈剂量依赖性，主要位于类器官外周区域。选择中等剂量（3.6×1010vg/org）进行后续治疗，以平衡表达效率与交叉校正潜力。蛋白质印迹分析证实，治疗后CDD类器官中CDKL5蛋白表达得以恢复，TATk-CDKL5组与CDKL5组表达水平相当甚至更高。然而，免疫染色显示蛋白表达仅限于部分细胞。对CDKL5直接磷酸化底物EB2的分析显示，CDD类器官中EB2磷酸化水平显著降低，治疗后仅有轻微但不完全的恢复。
电生理活动改善
MEA记录显示，CDD皮质类器官表现出神经元网络超兴奋性，包括放电频率、爆发次数和网络同步性指数（Synchrony Index）升高。尽管传统CDKL5治疗未能显著改善大多数电生理参数，但TATk-CDKL5治疗显著降低了网络爆发的数量和同步性指数，表明其在调节异常网络活动方面更具优势。
细胞增殖与存活恢复
CDD类器官表现出细胞增殖减少（Ki-67信号强度和PCNA阳性细胞数降低）和细胞密度下降。TATk-CDKL5治疗能显著恢复增殖水平和细胞密度，而传统CDKL5治疗效果有限。同时，CDD类器官中细胞凋亡增加（Cleaved Caspase-3阳性细胞和固缩核增多），神经元（NeuN阳性）凋亡尤为明显。TATk-CDKL5治疗能显著降低凋亡水平，恢复神经元标志物NeuN和MAP2的信号强度，而传统CDKL5治疗改善效果不显著。
讨论
本研究在人类CDD皮质类器官模型中验证了基于交叉校正机制的TATk-CDKL5基因疗法的优越性。尽管类器官无血管结构限制了病毒和治疗蛋白的均匀分布，但TATk-CDKL5仍在局部表现出更强的功能恢复能力，特别是在改善细胞增殖、存活和网络活动方面。这支持了其通过分泌和细胞穿透特性实现更广泛细胞校正的潜力。研究结果强调了CDKL5在人类神经发育中的关键作用，并证实患者来源类器官是评估神经发育障碍治疗策略的有价值平台。
结论
在CDD患者来源的皮质类器官中，基于TATk-CDKL5的基因疗法在恢复细胞表型和部分功能缺陷方面优于传统CDKL5递送方法。这为开发针对CDD及其他类似广泛性脑部疾病的更有效治疗策略提供了概念验证。未来的研究需优化载体递送效率，并评估该疗法的长期效果。
