《Frontiers in Immunology》：FBXO9 promotes anti-tumor immunity via degradation of PD-L1 in pancreatic cancer
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本研究发现F-box蛋白9（FBXO9）作为PD-L1的新型调控因子，通过直接结合并促进PD-L1的泛素化降解，增强CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫。在胰腺癌中FBXO9表达下调与PD-L1水平呈负相关，且低表达预示不良预后。该研究揭示了FBXO9-PD-L1轴在肿瘤免疫逃逸中的关键作用，为联合免疫检查点阻断（ICB）治疗提供了新靶点。
引言
胰腺癌是全球癌症相关死亡的第七大原因，尽管诊断、化疗、放疗和联合疗法有所进展，但大多数患者生存率仍然较差。免疫检查点阻断疗法，特别是针对程序性死亡[1]/程序性死亡配体[1]（PD-1/PD-L1）的疗法，已成为癌症治疗的前沿。然而，在胰腺癌等癌症类型中，临床反应仍不理想。研究表明，PD-L1抑制剂的疗效显著受翻译后修饰（PTMs）的影响，尤其是泛素化。F-box蛋白是Skp1–Cullin–F-box（SCF）E3泛素连接酶复合物的底物识别亚基，可结合特定靶蛋白并促进其泛素化和蛋白酶体降解。FBXO9作为F-box蛋白家族成员，在多种癌症中发挥重要作用，但其在癌症免疫治疗调控中的作用尚不清楚。
方法
研究采用TCGA数据库和GSE183795队列进行生物信息学分析。通过免疫组织化学（IHC）染色检测人胰腺癌组织和癌旁正常组织中FBXO9和PD-L1蛋白表达。在Panc-1、Patu-8988和293T细胞系中进行FBXO9的敲低和过表达实验，通过CCK-8实验、伤口愈合实验和Transwell实验评估细胞活力、迁移和侵袭能力。建立裸鼠和C57BL/6小鼠皮下移植瘤模型，评估FBXO9对肿瘤生长和免疫细胞浸润的影响。采用免疫印迹（IB）、免疫共沉淀（IP）、蛋白质半衰期分析和泛素化实验等分子生物学技术探讨FBXO9与PD-L1的相互作用及调控机制。
结果
FBXO9低表达与胰腺癌不良预后密切相关
生物信息学分析显示，与正常组织相比，FBXO9在胰腺癌组织中表达显著降低。TCGA数据库、GSE183795队列和IHC分析均表明，FBXO9低表达与患者总生存期较差相关。IHC染色证实FBXO9在肿瘤组织中表达下调，且低FBXO9表达与TNM分期等临床参数相关。
FBXO9抑制细胞生长和肿瘤发生
在Panc-1和Patu-8988细胞中，FBXO9过表达抑制细胞活力，而FBXO9敲低增强细胞活力。伤口愈合和Transwell实验显示FBXO9过表达显著减弱细胞迁移和侵袭能力。在裸鼠皮下移植瘤模型中，FBXO9过表达显著延迟肿瘤生长并减少肿瘤重量。
FBXO9激活抗肿瘤免疫应答
TIMER数据库分析显示FBXO9表达与CD8+T细胞密切相关。在免疫健全的C57BL/6小鼠中，FBXO9过表达的Panc-02细胞形成的肿瘤生长显著减缓，肿瘤重量减轻，且肿瘤内CD8+T细胞浸润显著增加。FBXO9过表达的Panc-02细胞与健康C57BL/6小鼠脾细胞共培养后，细胞凋亡显著增加。
FBXO9下调胰腺癌中PD-L1蛋白
IHC分析显示FBXO9与PD-L1表达呈负相关。FBXO9过表达导致Panc-1、Patu-8988和293T细胞中PD-L1蛋白水平显著降低，而FBXO9敲低则增加PD-L1蛋白水平。流式细胞术证实FBXO9过表达降低细胞膜PD-L1水平。RT-qPCR分析显示PD-L1 mRNA水平未随FBXO9表达改变而变化，表明FBXO9在翻译后水平调控PD-L1。
FBXO9通过泛素化促进PD-L1降解
蛋白酶体抑制剂MG132增强PD-L1蛋白积累。FBXO9过表达显著缩短PD-L1蛋白半衰期。免疫共沉淀证实FBXO9与PD-L1在多个细胞系中存在相互作用。体内泛素化实验表明FBXO9过表达显著增强PD-L1的多聚泛素化。FBXO9 ΔF-box突变体延长PD-L1蛋白半衰期，破坏与PD-L1的结合，并几乎完全消除PD-L1的多聚泛素化，表明FBXO9的F-box结构域是PD-L1结合和泛素化所必需的。
讨论
免疫抑制和功能障碍是多种癌症的标志。免疫检查点阻断疗法如抗PD-1/PD-L1疗法显示出前所未有的临床疗效。PD-L1的调控机制复杂，涉及多种翻译后修饰。本研究首次发现FBXO9作为PD-L1的结合伴侣，直接泛素化并介导PD-L1在胰腺癌细胞中的降解。多个F-box蛋白被证实调控PD-1和PD-L1的稳定性。本研究证实FBXO9在胰腺癌中表达下调，且与患者不良预后相关。FBXO9通过其F-box结构域直接结合PD-L1并促进其泛素化降解，从而增强抗肿瘤免疫。
结论
FBXO9通过靶向PD-L1进行泛素化依赖性降解而发挥肿瘤抑制作用。FBXO9表达与PD-L1水平呈负相关，且低FBXO9表达与较差的临床结局相关。这表明FBXO9是一个有前景的治疗靶点，有可能提高免疫治疗的临床疗效。研究存在一些局限性，如是否还有其他F-box家族成员调控PD-L1、参与泛素化的特定赖氨酸残基和亚细胞区室尚未阐明，除CD8+T细胞外其他免疫细胞是否参与FBXO9介导的免疫调控有待明确，FBXO9过表达与抗PD-1/PD-L1疗法联合使用的益处需进一步验证。未来研究应探讨FBXO9的其他底物是否影响抗肿瘤免疫，验证FBXO22、β-TrCP和SPOP在胰腺癌中是否类似地靶向PD-L1降解，并在更多独立临床组织队列中验证本研究结果。
