《Transboundary and Emerging Diseases》：Detection and Characterization of Sindbis Virus Genotype IV in Mosquitoes From Slovenia
编辑推荐：
本研究首次在斯洛文尼亚的蚊虫媒介中检测到辛德毕斯病毒（SINV），通过全基因组测序鉴定其为基因IV型（SINV-IV），揭示了该基因型在中欧地区的循环。作者利用实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）对2020-2024年间采集的112,001只蚊虫（11,595个池）进行筛查，在5池环纹库蚊（Culex modestus）中检出病毒RNA。研究开发了针对SINV-IV的特异性引物扩增体系，获得近全长基因组序列（平均11,382 bp），系统进化分析显示斯洛文尼亚毒株（SINV-SLO）与俄罗斯、阿塞拜疆及中国的SINV-IV毒株亲缘最近。分子钟分析表明病毒进化速率为6.15×10-5替换/位点/年，推测斯洛文尼亚境内存在多次独立引入事件。该发现凸显了媒介监测对防控新发人兽共患病原体的重要意义。
背景
辛德毕斯病毒（Sindbis virus, SINV）是一种由蚊虫和鸟类传播的甲病毒（Alphavirus），在旧大陆分布广泛。蚊虫是SINV的主要传播媒介，而鸟类是其主要扩增宿主。SINV主要通过嗜鸟性的库蚊属（Culex）蚊虫传播，但也涉及脉毛蚊属（Culiseta）和伊蚊属（Aedes）。尽管分布广泛，但有症状的人类感染仅见于少数地理区域，如北欧，偶见于南非、澳大利亚和中国。基于部分E2基因的系统发育分析已鉴定出六个SINV基因型（I-VI）。其中，基因IV型（SINV-IV）的认知相对较少，已知包括KYZV LEIV-65A毒株、Stavropol毒株和中国的XJ-160毒株。尽管中国一项血清流行率研究显示19%的受试者对XJ-160毒株抗体呈阳性，但SINV-IV从未与人类疾病相关联。本研究旨在通过分析斯洛文尼亚蚊虫中SINV的存在，监测该病毒及其在当地的潜在循环。
材料与方法
2.1. 野外采样与蚊虫预处理
2020年至2024年间，在斯洛文尼亚全国226个地点进行了媒介和媒介传播病原体监测。蚊虫样本在4月至10月间每月采集一次。使用三种陷阱：BG-Sentinel陷阱、CDC光诱陷阱和Gravid陷阱。捕获的蚊虫在干冰上运输至实验室，并于-30°C储存直至形态学鉴定。蚊虫鉴定至物种水平，并根据物种、性别、地点和采样日期分组，每池最多50只个体。使用“MosKeyTool”进行形态学鉴定，不确定时通过扩增并测序细胞色素c氧化酶I（COI）基因进行分子鉴定。样本在生物安全柜中均质化，离心后取上清用于后续分析。
2.2. SINV分子检测
使用商业试剂盒从300 μL均质上清中提取核酸（NA）。SINV检测采用J?st等人描述的实时逆转录聚合酶链反应（real-time reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）方法，使用QuantStudio 7系统进行。
2.3. SINV基因组扩增子扩增的寡核苷酸引物对
为了快速确定基因型并设计用于全基因组扩增子测序的基因型特异性引物，首先对实时RT-PCR阳性的样本进行了针对nsP4基因保守区的甲病毒通用RT-PCR。通过Sanger测序获得部分nsP4序列，其提供了足够的系统发育分辨率以将检测到的病毒归入相应的SINV基因型。随后，使用PrimalScheme工具，基于所有四个已公开的完整SINV基因IV型基因组（GenBank登录号: AF103728.1, KF981618.1, MG679375.1, NC_075007.1）的比对，设计了用于扩增完整SINV基因组的引物对。最终设计了一个包含37对引物的扩增子系统，覆盖基因组从58到11,442核苷酸（nt）的区域。
2.4. PCR扩增与引物池优化
使用一步法RT-PCR试剂盒产生PCR扩增子。为了减少引物池中引物间的潜在相互作用，将原始的两个引物池细分为九个独立的引物池。
2.5. 扩增子测序
使用Native Barcoding Kit制备测序文库，并在GridION测序仪（使用R10.4.1流动槽）上进行纳米孔测序。 reads使用Dorado进行碱基识别。
2.6. 生物信息学与系统发育分析
使用FastQC进行原始数据质量检查，fastp进行修剪。修剪后的reads使用Minimap2比对至参考基因组AF103728.1。使用Samtools处理比对后的文件，并使用iVar trim去除引物序列。使用Samtools depth计算覆盖深度，使用Samtools consensus生成一致性序列。使用iVar调用变异，并使用SnpEff预测变异效应。
将新生成的5条斯洛文尼亚SINV序列与从NCBI数据库获取的69条全基因组SINV序列进行比对。使用IQ-TREE构建系统发育树，最佳模型为GTR+F+I+G4。
基于时间结构和根-尖回归分析筛选序列子集进行分子钟分析。使用BEAST进行贝叶斯马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）分析，运行6000万代，采用严格分子钟和合并贝叶斯天际线模型。使用Tracer评估收敛性，使用TreeAnnotator生成最大分支可信度（MCC）树。
结果
3.1. 蚊虫采样与病毒基因组检测
2020年至2024年间，共捕获112,001只蚊虫，分为11,595池。捕获的蚊虫属于伊蚊属（70%）、库蚊属（23%）、按蚊属（4%）、脉毛蚊属（1%）和Coquillettidia属（2%）。通过实时RT-PCR，在5池环纹库蚊（均为雌性）中检测到SINV RNA，这些蚊虫于2022年8月以及2024年7月、8月和9月在斯洛文尼亚东北部的Pomurska地区和Podravska地区通过CDC陷阱捕获。计算了最低感染率（MIR）。2022年Pomurska地区所有捕获标本的总体MIR为每1000只蚊虫0.31，2024年为0.10；而2024年Podravska地区的MIR达到1.91。在库蚊属蚊虫中，2022年Pomurska地区的MIR最高，接近每1000只4.5。2024年，该值显著降低。
3.2. SINV基因IV型测序扩增子系统的开发与分子特征
获得的序列与BLAST NT数据库中最相似的序列进行比较，结果显示与归类为基因IV型的SINV最相似，特别是分离株XJ-160、Kyzylagach LEIV-65A、Stavropol和Volgograd 673/19。成功从所有5个SINV阳性蚊池中直接生成了近全长的基因组。序列平均长度为11,382 bp，GC含量为48%。变异分析显示，基于参考基因组AF103728.1，这些基因组平均包含94个主要的同义变异（等位基因频率>0.5）和35个主要的错义突变（等位基因频率>0.5）。平均测序深度为94。
5个斯洛文尼亚SINV基因组在基因IV型内形成一个单系群，与其他基因IV型SINV基因组的核苷酸差异小于2%。相比之下，新SINV基因组与基因I型之间的核苷酸同一性低于80%，与基因II型和V型的同一性更低（70%）。在蛋白质水平观察到相似趋势，基因IV型内部氨基酸（aa）同一性为99%，与基因I型的同一性为94%–96%，与基因II型为91%–93%，与基因V型仅为78%–89%。
3.3. SINV序列的分子特征
将斯洛文尼亚SINV序列与NCBI参考SINV基因组（NC_001547；基因I型）比较，发现2149个核苷酸差异（18%）。但与最相似的序列XJ-160（AF103728.1）相比，仅发现233个核苷酸差异。在非结构蛋白中观察到较高的核苷酸差异，而在结构蛋白中仅检测到少量错配。斯洛文尼亚SINV序列与参考株相比有33个氨基酸变化，与XJ-160株相比有52个氨基酸变化。
3.4. 分子钟
SINV基因IV型的进化速率估计为6.15 × 10-5替换/位点/年（中位数=6.15 × 10-5；95% HPD：4.9 × 10-5– 7.4 × 10-5）。斯洛文尼亚SINV序列的最晚共同祖先（tMRCA）可追溯到85年前（95% HPD：67.0–107.7年）。尽管最接近的毒株XJ-160于1990年在中国采样，但分子钟模型估计斯洛文尼亚毒株与XJ-160的tMRCA为121年（95% HPD：96.2–148.7年）。斯洛文尼亚SINV序列与1990年在中国分离的毒株最相似，但两个种群似乎在100多年前就已分化。
讨论
在斯洛文尼亚为期4年的媒介传播病原体监测中，从226个地点捕获了112,001只蚊虫。在11,454个蚊池中，仅在5个池中检测到SINV RNA，均采集自斯洛文尼亚东北部Ledava湖附近和Podvinci自然保护区。SINV在环纹库蚊中检测到，该物种广泛分布于欧洲、亚洲和北非的温带地区。此前在捷克共和国、西班牙和罗马尼亚的野外监测中也曾从该物种中检测到SINV。这些蚊虫在夏季最为丰富，喜欢在稻田和沼泽等永久性植被栖息地繁殖。环纹库蚊以多种鸟类为食，也具有嗜人性，使其成为新兴病毒的重要媒介。Podvinci的池塘是许多鸟类的重要筑巢区，Ledava湖也是候鸟迁徙路线，这可能在该病毒的引入和/或建立中起作用。
人类感染的发生受多种因素影响。2022年Pomurska地区库蚊的MIR为每1000只4.48。2024年，Pomurska地区库蚊的MIR为0.79，Podravska地区为1.91。相比之下，德国多次在蚊虫中检测到SINV，但从未报告过人类辛德毕斯热病例，其记录的MIR约为每1000只0.9。而在瑞典的地方性流行区，MIR高达每1000只16.7，几乎是斯洛文尼亚2022年观察到的比率（4.48）的四倍。MIR的差异可能是斯洛文尼亚未检测到人类SINV感染的一个解释。另一个可能解释是斯洛文尼亚检测到的病毒特定基因型。系统发育分析显示，斯洛文尼亚发现的SINV（SINV-SLO）与XJ-160、Kyzylagach-LEIV65A和Stavropol分离株最相似，均属于基因IV型。该组中检测到的病毒均未与人类疾病相关联。而大多数引起人类疾病的欧洲SINV分离株属于基因I型，SINV-SLO在核苷酸水平上与其平均差异为17.7%。根据序列数据，SINV-SLO很可能是由鸟类从东北方向引入斯洛文尼亚，因为这些地点是来自北欧和东欧许多鸟类的迁徙途径点和筑巢区。
先前对SINV-I引入和建立的研究表明，它仅在1920年代从中部非洲一次引入北欧。一项近期研究也描述了SINV在西班牙南部的新的引入和建立，西班牙序列的tMRCA将引入时间追溯到4.66年前。由于我们在两个不同地点、两个非连续年份检测并成功测序了SINV基因IV型，我们研究了其tMRCA。计算出的SINV基因IV型进化速率与SINV基因I型的进化速率相当。根据计算的分子钟，如果病毒在当地鸟类种群中越冬，我们预计会看到2022年和2024年从同一地点（Ledava湖）采集的样本病毒序列存在1.4个核苷酸替换。然而，2022年和2024年从Ledava湖获得的序列差异达49个核苷酸。同年内在斯洛文尼亚东北部两个地点（Podvinci和Ledava湖）检测到的SINV也观察到相同数量的差异。利用分子钟，我们计算出2022年和2024年同一地点采样的SINV序列之间的估计tMRCA时间为25.9年。基于tMRCA，我们假设斯洛文尼亚境内至少存在三次独立的SINV基因IV型引入事件，而非本地越冬。但需要更多SINV基因IV型序列来证实越冬假说。
结论
本研究首次证实了SINV在斯洛文尼亚媒介中的存在。我们开发了一种扩增子测序方案，发现SINV-SLO属于基因IV型。该SINV基因型在东欧、俄罗斯和亚洲更为流行。我们的发现强调了在欧洲监测媒介和新发病原体的重要性。
