《Journal of Biological Chemistry》：Andrographolide targets Syndecan4 to impair its interaction with Syntenin and inhibits the biogenesis of small extracellular vesicles
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本研究聚焦于肿瘤中高表达的Syndecan4 (SDC4)的蛋白降解机制不明及其促进小细胞外囊泡(sEVs)生成的关键科学问题。研究人员通过系统性实验，揭示了SDC4通过γ-分泌酶-蛋白酶体和非依赖Syntenin的内吞-溶酶体两条途径降解的新机制，并首次发现天然化合物穿心莲内酯(AGO)能直接结合SDC4，特异性阻断其与Syntenin的相互作用，促进SDC4溶酶体降解，从而有效抑制sEVs的生成和功能。该研究为靶向SDC4-sEVs轴治疗癌症提供了新的药理配体和理论依据。
在癌症研究的复杂图景中，肿瘤细胞不仅自身具有强大的增殖和侵袭能力，还能通过释放一种名为小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs）的微小“信使”来影响周围环境，促进肿瘤的生长和扩散。这些直径在30-150纳米之间的囊泡如同微型的物流包裹，携带蛋白质、核酸等重要信息，在细胞间通讯中扮演着关键角色。其中，一个名为多配体聚糖4（Syndecan4, SDC4）的跨膜蛋白备受关注，它在多种肿瘤中过度表达，其积累与sEVs的生成增加密切相关，从而驱动肿瘤进展。然而，科学家们对于SDC4蛋白自身的“生命周期”终结——即其降解机制——却知之甚少，先前的研究甚至出现了相互矛盾的结论，这阻碍了针对SDC4的有效靶向治疗策略的开发。
为了揭开SDC4降解的神秘面纱，上海中医药大学交叉医学研究院化学生物学中心的研究团队在《Journal of Biological Chemistry》上发表了一项重要研究。他们发现，SDC4的降解并非单一途径，而是存在一条精巧的“双通路”调控机制。在正常情况下，细胞膜上的SDC4会持续性地被“切割”（这一过程称为脱落），产生一个留在膜上的C端跨膜片段（C-terminal transmembrane fragment, CTF）。这个CTF片段随后被γ-分泌酶（γ-secretase）进一步切割，释放出的细胞内片段最终被蛋白酶体（proteasome）快速降解，以此维持SDC4的稳态平衡。而在细胞发生内吞或处于应激状态时，SDC4-CTF则转向通过内吞-溶酶体（endocytosis-lysosome）途径被降解。有趣的是，研究团队发现，一个名为Syntenin的细胞内支架蛋白，能够像“稳定锚”一样，通过与SDC4的直接结合，保护SDC4-CTF免受溶酶体降解。
机制的澄清为寻找干预工具奠定了基础。研究人员运用一种名为微尺度热泳动（Microscale Thermophoresis, MST）的高通量筛选技术，从天然化合物库中成功“锁定”了一个能与SDC4直接结合的小分子——穿心莲内酯（Andrographolide, AGO），它是中药穿心莲的主要活性成分。深入探究发现，AGO能够精准地插入SDC4与Syntenin之间，特异性阻断两者的相互作用。失去了Syntenin的保护，SDC4-CTF更多地走向溶酶体降解的命运，其蛋白水平显著下降。更重要的是，AGO处理有效降低了sEVs中SDC4-CTF的含量，并显著抑制了sEVs的生成数量和其被受体细胞摄取的能力。
本研究主要应用了以下关键技术方法：利用蛋白质印迹法（Western blot）分析蛋白表达与降解；通过微尺度热泳动（MST）技术和药物亲和反应靶点稳定性（DARTS）实验验证AGO与SDC4的直接结合；采用免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down和邻近连接技术（PLA）检测蛋白质相互作用；使用纳米颗粒跟踪分析（NTA）和透射电子显微镜（TEM）表征sEVs的浓度、粒径和超微结构；并通过细胞成像技术观察蛋白定位与sEVs摄取。
1. MG132抑制SDC4-CTF的降解
研究人员首先探讨蛋白酶体是否参与SDC4-CTF的降解。他们发现，蛋白酶体抑制剂MG132能浓度和时间依赖性地显著提高人结直肠癌细胞系HCT116中SDC1-CTF和SDC4-CTF的蛋白水平，但不影响其全长（Full-length, FL）蛋白。其他几种特异性更强的蛋白酶体抑制剂（如Carfilzomib, Ixazomib, Bortezomib）则无此效果，提示MG132的作用可能涉及其对多种蛋白酶活性的广泛抑制。通过敲低蛋白酶体亚基（如PSMD14, PSMD2等）进一步证实了蛋白酶体途径的参与。这些结果表明，蛋白酶体途径在SDC4-CTF的基础降解中发挥作用。
2. SDC4-CTF被γ-分泌酶进一步切割释放胞质片段
SDC4-CTF如何被位于胞质中的蛋白酶体降解？研究发现，SDC4-CTF像许多单次跨膜蛋白一样，其跨膜区含有GGxxG motif，是γ-分泌酶的潜在底物。抑制γ-分泌酶活性（使用抑制剂DAPT或敲低其催化亚基PSEN1）能显著稳定SDC1-CTF和SDC4-CTF。如果同时抑制上游的基质金属蛋白酶（MMPs，负责初始的脱落切割，其抑制剂为GM6001），则DAPT和MG132的稳定效应被削弱。这说明SDC4的降解遵循“脱落–γ-分泌酶切割–蛋白酶体降解”的经典顺序。SDC1-CTF对此通路更敏感，降解更快。
3. Syntenin稳定SDC4-CTF抵抗内吞-溶酶体降解
除了蛋白酶体通路，研究也关注了溶酶体途径。溶酶体抑制剂Bafilomycin A1 (BAF1)能稳定SDC1-CTF和SDC4-CTF。值得注意的是，饥饿处理（EBSS）能快速诱导SDC4-CTF降解，同时其结合蛋白Syntenin也被共降解，提示存在一条饥饿诱导的内吞-溶酶体降解途径。过表达Syntenin能轻微提高SDC4-CTF水平。更重要的是，当SDC4的PDZ结合域突变（SDC4ΔC2），使其无法与Syntenin结合时，SDC4-CTF的稳定性显著低于野生型（SDC4WT）。在不同癌细胞系中，SDC4-CTF与Syntenin的蛋白水平呈正相关。这些结果证明，Syntenin通过直接结合，保护SDC4-CTF免于内吞-溶酶体降解。
4. AGO直接结合SDC4并特异性抑制其与Syntenin的相互作用
利用MST技术，研究人员发现天然化合物AGO能直接结合SDC4，跨膜区对其结合至关重要。DARTS实验证实AGO的结合能稳定SDC4蛋白。关键的是，AGO能特异性破坏SDC4与Syntenin的相互作用，而对SDC4与其他伙伴（如β-catenin, Rab5等）的结合无影响。这一结论通过免疫共沉淀、GST pull-down、邻近连接实验和共定位成像等多种方法得到了验证。
5. AGO以细胞类型依赖性方式促进SDC4内吞-溶酶体降解
在SW480等部分结直肠癌细胞中，AGO能浓度和时间依赖性地降低SDC4-CTF（尤其是CTF）的蛋白水平及细胞表面SDC4的量，但在HCT116等细胞中效果不明显，表明其作用具有细胞类型特异性。AGO并不抑制SDC4的脱落，也不主要通过抑制NF-κB通路影响其转录，而是促进了SDC4的溶酶体降解，这一点在溶酶体抑制剂BAF1能逆转AGO效应中得到支持。AGO破坏了Syntenin对SDC4的稳定作用，从而可能将SDC4导向降解命运。
6. AGO抑制sEVs的生成和功能
由于SDC4-Syntenin复合物对sEVs生物发生至关重要，研究人员进一步考察了AGO对sEVs的影响。结果显示，AGO处理显著降低了sEVs中SDC1-CTF和SDC4-CTF的含量。纳米颗粒跟踪分析表明sEVs的总数量减少且尺寸变小。电镜观察发现AGO处理细胞的多泡体（MVBs，sEVs的前体）形成受抑。此外，来自AGO处理细胞的sEVs被受体细胞摄取的能力也下降。这表明AGO通过靶向SDC4-Syntenin相互作用，有效抑制了sEVs的生成和功能。
综上所述，本研究系统阐明了SDC4通过蛋白酶体和溶酶体双重途径降解的分子机制，并首次发现天然化合物穿心莲内酯（AGO）是SDC4的直接小分子配体。AGO通过特异性阻断SDC4与Syntenin的相互作用，促进SDC4的溶酶体降解，进而抑制sEVs的生成和功能。这项研究不仅解决了关于SDC4降解机制的长期争议，更重要的是为靶向SDC4-sEVs轴以干预癌症进展提供了新的先导化合物和理论支持，具有重要的科学意义和潜在的应用前景。当然，AGO抑制sEVs是否完全依赖于SDC4，以及AGO促进SDC4降解的精细细胞机制，仍是未来需要深入探索的方向。
