《Journal of Biological Chemistry》：Alzheimer’s disease-linked
ACE variants increase ACE1 catalytic activity and production of angiotensin II
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本研究针对阿尔茨海默病（AD）关键风险基因ACE，深入解析了其罕见编码变异T916M与N1036K的致病机制。研究人员通过构建SH-SY5Y神经母细胞瘤稳转细胞系，发现这两种变异不改变ACE1蛋白转运，但显著提升其膜结合形式的催化活性，导致神经毒性肽Ang II过量产生。该工作为理解中枢肾素-血管紧张素系统（RAS）在AD病理中的作用提供了新证据，为靶向RAS的干预策略奠定了理论基础。
在大脑的复杂世界里，阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）如同一个难以破解的谜题，尤其是占病例绝大多数的晚发性阿尔茨海默病（late-onset Alzheimer’s disease, LOAD）。与由明确基因突变导致的家族性AD不同，LOAD的发病与众多基因风险因素相关，但它们如何具体驱动疾病进程，至今仍笼罩在迷雾之中。血管紧张素转换酶（Angiotensin-converting enzyme, ACE）基因便是其中一个被确认的LOAD风险位点，但ACE1蛋白在AD大脑中的角色却显得颇为“矛盾”。一方面，它能够切割有毒的Aβ42，可能起到保护作用；另一方面，它又是产生血管紧张素II（Angiotensin II, Ang II）的关键酶，而Ang II的过度产生与神经退行性变相关。更令人困惑的是，AD患者大脑中的ACE1表达和酶活性反而升高了。这种复杂性使得阐明ACE1在AD中的确切机制成为当务之急。
为了拨开这层迷雾，由Miranda A. Salvo和Leah K. Cuddy等研究人员领导的研究团队，将目光投向了罕见的ACE编码变异。他们此前已经发现一个名为R1279Q的罕见ACE变异能够通过增加神经元ACE1和中枢肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system, RAS）信号传导，诱导与年龄相关的海马神经退行性变。在本项发表于《Journal of Biological Chemistry》的研究中，他们进一步报告了另外两个与AD发病风险增加相关的ACE变异：rs3730043 (T916M) 和 rs142947404 (N1036K)，并深入探究了它们影响ACE1蛋白功能的具体机制。
研究人员利用全基因组和全外显子组测序技术，从晚发性AD家系中鉴定出T916M和N1036K这两个罕见的ACE编码变异。为了在细胞水平上模拟和研究这些变异的功能，他们在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中构建了稳定表达野生型或突变型（T916M, N1036K, R1279Q）ACE1的细胞系。通过对这些细胞系的系列分析，主要应用了以下关键技术方法：利用酶联免疫吸附测定（ELISA）和蛋白质印迹法（Western Blot）定量检测ACE1蛋白的表达水平与蛋白稳定性；通过流式细胞术精确测量细胞表面ACE1的丰度；采用基于荧光底物的酶活性分析法和Ang II生成的ELISA检测，评估ACE1的催化活性；此外，还使用了细胞凋亡检测（TUNEL assay）和内质网应激标志物检测以评估细胞毒性。研究所用的遗传数据来源于美国国家心理健康研究所（NIMH）和美国国家衰老研究所阿尔茨海默病测序项目（NIA ADSP）的队列。
Identification of rare ACE variants through WGS and WES
研究人员通过对446个AD家系进行深度全基因组测序（WGS）分析，筛选出两个具有潜在功能影响的罕见错义变异：rs3730043 (T916M) 和 rs142947404 (N1036K)。家系分析和基于人群的病例对照分析均提示这两个变异与AD风险存在关联。
ACE1 stable cell lines display unaffected protein degradation dynamics and survival phenotypes
成功构建稳定表达各ACE1变异的SH-SY5Y细胞系后，研究人员首先确认这些突变体ACE1的表达并未引起蛋白质稳态失衡（如泛素化蛋白积累、内质网应激）或导致细胞凋亡和DNA损伤增加。这表明这些ACE1风险变异并非通过引发明显的蛋白错误折叠或细胞死亡直接导致AD病理。
The R1279Q ACE1 mutant causes increased abundance of ACE1 protein on the cell-surface
对ACE1蛋白亚细胞定位的研究发现，与野生型相比，T916M突变体细胞表面的ACE1丰度显著降低，而其从细胞膜上脱落（shedding）的程度增加；相反，R1279Q突变体则表现出细胞表面ACE1丰度的增加和脱落减少的趋势。N1036K在这些方面与野生型无显著差异。这表明不同的ACE1变异通过影响蛋白的膜定位和脱落，可能以不同方式影响其功能微环境。
T916M and N1036K mutants have increased membrane-bound ACE1 catalytic activity
最关键的发现在于ACE1的催化功能。酶活性分析显示，当活性数据经过ACE1蛋白量标准化后，T916M和N1036K突变体均表现出比野生型更高的催化效率。在功能验证中，用血管紧张素I（Ang I）处理细胞后，T916M和N1036K突变细胞系产生了更高水平的Ang II。特别重要的是，当实验排除了细胞膜的影响，仅使用从细胞培养基中收集的可溶性ACE1（sACE1）与Ang I在体外反应时，N1036K sACE1产生的Ang II反而低于野生型，而T916M和R1279Q与野生型无差异。这清晰地表明，T916M和N1036K突变主要是通过增强膜结合ACE1的催化活性来增加Ang II的生成。另一方面，在研究ACE1对Aβ42的降解能力时，无论是在细胞模型还是体外酶促反应中，均未发现ACE1过表达或突变能显著增强Aβ42的降解，提示在该实验体系中，ACE1可能并非主要的Aβ降解酶，其致病机制更可能通过Ang II等途径实现。
总结与讨论部分指出，本研究重点阐释了T916M和N1036K这两个AD相关ACE罕见变异的新机制：它们并非通过改变蛋白稳定性或引起细胞毒性，而是通过特异性增强膜结合ACE1的催化活性，导致神经毒性肽Ang II的过量产生。这与之前发现的R1279Q变异通过增加ACE1蛋白量来提升活性的机制有所不同。研究人员推测，位于ACE1催化C-结构域α螺旋帽区的T916M和N1036K突变可能通过引起局部构象变化，从而增强其催化效率。这些发现为“AD患者大脑中ACE1活性升高”这一临床观察提供了可能的遗传解释和分子机制。研究结果强有力地支持了ACE1活性、Ang II以及中枢RAS在LOAD病理中的重要作用，并提示靶向这一通路（例如使用ACE抑制剂或血管紧张素受体阻滞剂）或许是值得深入探索的治疗策略。尽管罕见变异本身不代表大多数散发性AD病例，但解析它们的功能能为了解ACE1在AD中的普遍致病机制提供关键视角。未来的研究需要在更复杂的体内模型（如动物模型）中验证这些发现，并进一步探讨ACE1其他底物在AD中的作用。
