《Journal of Biological Chemistry》：Transcriptional plasticity of stromal cells amplifies their differentiation efficiency
in vitro
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本研究针对骨髓基质细胞（MSCs）谱系定向的可塑性这一争议性问题，通过体外交替暴露于成骨和成脂诱导剂，结合bulk与单细胞RNA测序等技术，揭示了细胞类型特异性转录网络非但不抑制反而促进其获得相反表型。研究发现，谱系特异性基因在干细胞状态即被“预激活”，且成脂预刺激可显著增强基质细胞的成骨分化能力，甚至挽救成骨分化能力低下的原代细胞。这为理解骨质疏松等疾病中骨量减少与骨髓脂肪增加的反比关系提供了新的分子支持，并提示了通过调控细胞可塑性进行骨再生治疗的新策略。
骨骼是一个动态器官，终身都在进行着骨吸收与骨形成的重塑过程。在健康个体中，这两者维持着精妙的平衡。然而，随着年龄增长，骨量会显著减少，这主要与骨形成能力下降有关。一个引人关注的现象是，骨量减少往往伴随着骨髓脂肪体积的增加，这种现象在衰老和特发性骨质疏松症患者中尤为明显。这种骨与脂肪组织之间的“此消彼长”关系，其背后机制一直是科学家们探索的焦点。传统观点认为，这可能是由于骨髓中共同的基质祖细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）的谱系定向发生了偏移，即更多地向脂肪细胞（adipocytes）分化，而非成骨细胞（osteoblasts）。更有假说提出，成熟的成骨细胞可能直接转分化（trans-differentiation）为脂肪细胞，从而加剧了骨量的流失。然而，由于缺乏有效的人体谱系追踪技术，这一假说在人类骨骼系统中尚未被完全证实。细胞在分化过程中，其转录网络的重编程是必不可少的，但细胞类型特异性的转录网络在多大程度上调节着基质细胞内部的可塑性，仍然是一个未知的领域。
为了深入探究这一问题，来自丹麦欧登塞大学医院分子内分泌与干细胞研究单元（KMEB）的Ali Jasim Mohammad Jamil、Mikkel ?rnfeldt N?rg?rd、Emilie Grupe和Alexander Rauch的研究团队在《Journal of Biological Chemistry》上发表了他们的最新研究成果。他们利用永生化的人骨髓来源基质细胞（hBMSC-TERT4细胞），进行了一项精心设计的体外研究，系统地分析了当细胞反复、交替地暴露于成骨或成脂诱导剂时，其细胞表型、基因表达和表观遗传特征的动态变化。
研究人员首先证实，hBMSC-TERT4细胞在体外能够成功分化为具有基质矿化能力的成骨细胞和具有脂滴积累的脂肪细胞。出乎意料的是，预先将细胞诱导向一个谱系（例如成脂分化），不仅没有削弱其向相反谱系（例如成骨分化）分化的能力，反而在一定程度上增强了下一次向相反谱系分化的效率。例如，经过成脂预刺激的细胞，后续表现出更强的基质矿化能力。这一“促进作用”在基因表达水平也得到了印证，成骨标志基因如ALPL的表达在成脂预刺激后的细胞中诱导得更高。
为了在单细胞分辨率下揭示这种可塑性，研究团队进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。分析结果清晰地显示，无论是从未分化状态直接分化，还是从预分化状态经谱系转换而来，最终获得高度分化特征的细胞在转录组水平上几乎无法区分。这表明细胞的转录重编程遵循着相似的路径，最终汇聚到相同的终末状态。研究还发现，尽管大部分细胞响应了诱导剂的转换，但总有一小部分细胞（尤其是在从成脂诱导转换为成骨诱导的培养物中）维持着其原有的成熟脂肪细胞基因特征，对新的诱导信号表现出“抵抗”。这提示脂肪细胞的分化可能具有更强的自我维持性。
更令人惊讶的是，当研究人员让细胞经历多次、快速的谱系诱导剂转换（例如每4天切换一次诱导环境，持续32天）后，在同一个培养体系中，他们竟然同时观察到了具有强烈碱性磷酸酶（ALP）活性的矿化基质区域和充满脂滴的脂肪样细胞。通过单核RNA测序（snRNA-seq）技术，他们甚至鉴定出了一群同时高表达成骨细胞特征基因（如POSTN, RUNX2）和脂肪细胞特征基因（如ADIPOQ, PLIN1）的细胞，这为“双表型”细胞的存在提供了直接证据。
机制上的探索将研究引向了表观遗传层面。通过整合先前发表的染色质可及性（DNase-seq）和增强子标记（MED1 ChIP-seq）数据，研究人员发现，那些在谱系转换后能被更强诱导的基因，其附近的增强子在干细胞状态就具有一定的“预激活”（primed）状态，并且在经历相反的谱系诱导时，这些增强子区域仅发生适度的活性变化，而非完全沉默。这种表观遗传的“印记”可能为细胞在转换诱导条件后能够快速、高效地启动另一套谱系特异性基因程序奠定了基础。
本研究主要应用了以下关键技术：利用永生化人骨髓基质细胞（hBMSC-TERT4）和生物样本库来源的原代人间充质基质细胞进行体外成骨/成脂诱导分化；通过阿尔新红（Alizarin Red）染色、油红O（Oil Red'O）染色、碱性磷酸酶（ALP）活性检测等进行细胞表型分析；采用批量RNA测序（bulk RNA-seq）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单核RNA测序（snRNA-seq）进行转录组分析；利用已发表的DNase-seq和MED1 ChIP-seq数据进行增强子动态分析；并利用免疫缺陷小鼠异位成骨模型进行体内功能验证。
研究结果
预分化并未削弱向相反谱系分化的能力
研究发现，hBMSC-TERT4细胞即使预先暴露于相反谱系的诱导剂中，其后续的成骨或成脂分化潜力也未被削弱。相反，在群体水平上，细胞表现出高度的表型可塑性。
hBMSC-TERT4细胞在转换谱系诱导剂后表现出巨大的转录水平可塑性
批量RNA测序分析显示，当分化培养基从一种谱系诱导剂转换为另一种时，细胞能够迅速关闭原有的谱系特异性基因程序，并激活新的基因程序。主成分分析（PCA）和谱系特异性基因签名分析均表明，转换后的细胞其转录组特征更接近于最终诱导条件对应的终末分化状态，而非其起始状态。
scRNA-seq分析表明从未分化或预分化细胞产生的谱系定向具有相似性
单细胞水平的数据证实，无论细胞的分化历史如何，最终获得高度分化特征的细胞在转录组上高度相似。伪时间轨迹分析显示，直接分化和经谱系转换的细胞沿着几乎相同的路径进行转录重编程。同时，也鉴定出一小部分对诱导剂转换不响应的细胞。
预定向增强了基质细胞的分化潜能
功能实验证明，预先暴露于成脂诱导剂可显著增强hBMSC-TERT4细胞和原代基质细胞后续的成骨分化能力（表现为更强的基质矿化和ALP活性），甚至在体外挽救了某些成骨分化能力低下的原代细胞。在免疫缺陷小鼠体内的异位成骨实验进一步表明，经成脂预处理的、具有成骨能力的hBMSC-TERT4细胞，其体内骨形成能力得到增强。
hBMSC-TERT4细胞表现出重复的转录可塑性
即使经过多次谱系诱导剂的交替转换，细胞在整体转录组、谱系特异性基因签名和选定标志物表达上，依然能够响应新的诱导信号，表现出重复的可塑性。长期交替诱导的培养物中同时存在矿化和脂滴积累现象，单核测序揭示了同时表达成骨和成脂基因特征的细胞亚群。
谱系转换与成骨和成脂基因的独特表观遗传特征相关
表观遗传数据分析揭示，那些在谱系转换后能被更强诱导的基因，其附近的增强子在干细胞状态具有更高的基础活性（对于成骨基因），或在经历相反谱系诱导时仍能保持一定的可及性和MED1招募（对于成脂基因）。这种差异性的表观遗传状态可能与基因在转换过程中的不同响应能力有关。
讨论与结论
该研究系统地揭示了人骨髓基质细胞在体外具有惊人的细胞和转录可塑性。研究表明，细胞类型特异性的转录网络并非不可逾越的障碍，反而可能在一定条件下促进细胞获得相反的谱系特征。一个关键的发现是，预先的谱系定向（尤其是成脂定向）能够“训练”细胞，使其对后续的、甚至是相反的诱导信号产生更强的响应，从而放大其分化效率。这种效应可能与特定基因位点的表观遗传“预激活”状态有关。
这项研究为理解骨髓中骨与脂肪平衡的调控提供了新的视角。它不仅支持了基质祖细胞谱系定向偏移的假说，也为成熟细胞通过转分化参与病理过程（如骨质疏松中的骨丢失）的可能性提供了分子层面的支持。研究发现的可塑性增强分化策略，为改善基于基质细胞的再生医学疗法（例如针对骨缺损或骨质疏松的细胞治疗）提供了新的思路。最后，研究提示，体内微环境（niche）的稳定性，而非细胞内在的终末分化状态，可能是限制体内谱系转换的主要因素。这为未来探索通过调控局部微环境来干预骨相关疾病开辟了新的方向。
