固定化的外源蛋白酶K能够促进中温厌氧条件下聚乳酸与食物废弃物的协同消化

《Journal of Environmental Management》：Immobilized exogenous proteinase K enhances mesophilic anaerobic co-digestion of polylactic acid and food waste

可降解塑料PLA/PBAT blend通过嵌入蛋白酶K（Pro K）显著提升厌氧共消化水解效率（7.3%→19.3%）和甲烷产量（311.37 mL/g·VS?1），基因组学揭示Pro K调控乳酸-丙酸-乙酸代谢通路及甲烷生成过程。

　　

王世卓|张涛|史阳|张雅蕾|范建伟|沈峥

中国上海同济大学环境科学与工程学院，水污染控制与绿色资源回收国家重点实验室，200092

摘要

水解效率的限制阻碍了塑料的厌氧生物降解，在与有机底物的共消化过程中导致动力学失衡。为了解决这一问题，在食品废弃物（FW）和商业聚乳酸（PLA）生物降解塑料（BPs）中嵌入了蛋白酶K（Pro K），以利用其针对PLA的特异性降解能力。通过将经典模型方程与宏基因组分析相结合，研究了酶在厌氧微生物降解中的调控机制。结果表明，在水解过程中，酶的增强作用提高了水解速率，使BPs的降解率从7.3%提升至19.3%。在整个产氢/产酸过程中，微生物的级联反应被激活，促进了“乳酸-丙酸-乙酸”代谢途径的方向性增强。在产甲烷过程中，甲基氧化受到抑制，同时促进了氢营养型产甲烷作用，使得甲烷产量增加了23.32%（311.37 mL/g·VS_added^?1）。宏基因组分析揭示了Pro K对厌氧代谢基因途径的调控作用，为加速BPs降解和提高甲烷产量提供了一种新策略。

引言

全球塑料污染危机促使对传统塑料实施了严格的监管禁令，迫切需要可持续的替代品（Aubin等人，2022年）。生物降解塑料（BPs）作为一种关键解决方案应运而生，具有双重优势：（1）可再生原料来源；（2）能够完全被微生物矿化为简单化合物（CO₂、H₂O、CH₄）（Paul-Pont等人，2023年）。预计到2029年，BPs的产量将达到573万吨（Zhao等人，2025年），它们是向循环经济过渡的关键技术。按产量计算，三种主要的BPs是聚乳酸（PLA）、聚对苯二甲酸丁酸乙二醇酯（PBAT）和淀粉基塑料，合计占全球产量的83%（Azka等人，2024年）。其中，PLA因良好的生物相容性、热塑性和加工性能而受到广泛研究和商业关注（Filiciotto和Rothenberg，2021年）。然而，纯PLA产品在实际应用中存在机械强度和韧性不足的问题（Xiong等人，2013年）。因此，通常将其与PBAT或淀粉混合使用以协同发挥性能优势（Pesaranhajiabbas等人，2023年）。目前，PLA已在包装、运输、农业、生物医学、纺织品和电子等多个领域得到应用，其中食品包装是最突出的应用领域（Cucina等人，2021年）。即使实施了废物分类，BPs和微塑料仍不可避免地会与食品废弃物一起进入城市厌氧消化（AD）设施（Mascheroni等人，2010年）。尽管与传统塑料相比，BPs的生物降解性更强，但其水解速率受到内在疏水性和高结晶度的限制，导致与食品废弃物的降解不同步（Liu等人，2025年）。PLA的高结晶度使其水解半衰期超过了食品废弃物的酸化速率，这种不同步性引发了一系列问题：（1）挥发性脂肪酸（VFAs）的积累；（2）系统pH值降至5.0以下；（3）产甲烷活性受到抑制；（4）甲烷产量减少30–50%（Shalem等人，2024年）。同时，BPs残余片段在消化系统中会导致设备磨损加剧和维护成本增加（Yu等人，2023年）。

最近的研究集中在提高BPs的水解效率上，酶促降解显示出巨大潜力。这些酶专门针对PLA分子中的酯键进行切割，生成寡聚物（Tang等人，2022年）。这些寡聚物可以穿透微生物膜并在细胞内完全矿化（Zumstein等人，2018年）。微生物分泌的主要用于PLA降解的酶包括蛋白酶（Zhang等人，2025年）、脂肪酶（Mistry等人，2022年）和角质酶（Qi等人，2017年）。然而，由于PLA的高疏水性和结晶区域，酶难以扩散到塑料表面，从而降低了吸附和与活性位点的结合，限制了水解效率（Furukawa等人，2018年）。将酶直接固定在目标BPs上可以缩短活性位点与聚合物之间的距离，降低结合能（Retnadhas等人，2024年）。例如，DelRe等人通过将脂肪酶纳米级嵌入聚己内酯（PCL）中，在24小时内实现了98%的降解率（DelRe等人，2021年）。Pro K在PLA表面的固定使局部酶浓度提高了八倍，并使水解速率翻倍（DelRe等人，2021年）。Liu等人进一步证明，在改性的PLA/PBAT混合物上涂覆Pro K显著优化了与食品废弃物的中温共消化降解效率，从2.61%提升至17.32%（Liu等人，2024年）。这证实了酶固定化在改善BPs厌氧共消化（AcoD）方面的可行性。然而，自由酶在复杂AD系统中容易迅速变性（Cui等人，2022年），这主要是由于微生物蛋白酶的降解作用。因此，这些酶的半衰期较短，回收和再利用面临挑战（Hegyesi等人，2019年）。此外，表面固定和涂层方法通常依赖于较弱的相互作用，如氢键和疏水力，导致酶在加工过程中或受到流体剪切应力时容易脱落。为了解决这些问题，将酶嵌入聚合物基质中提供了一种有前景的替代方案。这种方法将酶限制在网络内，形成了保护性微环境，有效屏蔽了剪切力、有机溶剂和表面活性剂的影响（Imam等人，2021年）。尽管有这些潜在优势，但关于嵌入处理后酶活性降低的机制仍存在不确定性。此外，这些固定化酶如何催化BPs的AcoD的详细机制也尚未完全明确。

在本研究中，Pro K被嵌入到切成10毫米薄膜的商业PLA塑料袋中，并与食品废弃物混合，以模拟真实的回收场景进行AcoD实验。与以往仅关注纯聚合物的研究不同，我们的工作使用了商业PLA/PBAT/淀粉混合物，使结论更具实用性。主要创新在于将酶嵌入方法与中温厌氧共消化（AcoD）相结合。我们首次采用了宏基因组分析，帮助我们理解了导致更好生物降解的微生物和功能变化。通过实验分析，我们发现：（1）Pro K通过定向富集水解优势微生物群落来提高微生物水解速率；（2）外源Pro K加速了AcoD系统中的中间产物转化，减轻了中间产物的抑制作用，同时提高了产甲烷菌的底物转化效率。这一策略对于缓解AD过程中底物降解不同步问题及促进BPs的循环利用具有重大潜力。

部分摘录

改性BPs的制备

为了确保负载酶材料的热稳定性和活性，并考虑制造成本，采用了原位浸渍方法将酶加载到BPs上（Weng等人，2023年）。基于我们团队之前关于食品废弃物和BPs共消化的研究，该研究选择了PLA/PBAT/淀粉作为塑料成分（Yu等人，2023年）。制造商提供了...

PLA/PBAT混合物的结构变化

根据酶固定原理（图1a），我们将Pro K嵌入的BPs称为PKBPs。对比分析显示，PKBPs在形态上发生了明显变化，包括材料表面的微孔和不规则球形附着物（图1b）。使用荧光异硫氰酸酯（FITC）染色的共聚焦激光扫描显微镜证实了Pro K的成功固定（图1c）。聚合物样本在两个关键时间点从AcoD过程中提取：

结论

在处理含有PLA/PBAT混合物的商业BPs时，传统方法面临水解速率慢和酶降解效率低等挑战。为了解决这些问题，我们将特定于PLA的Pro K固定在目标BPs中，以延长酶与底物的接触时间并增强催化活性。通过模型拟合、物理化学表征和宏基因组分析，阐明了酶嵌入增强降解的机制。

CRediT作者贡献声明

王世卓：撰写——初稿、方法论、实验设计、数据管理。张涛：验证、监督。史阳：实验设计、数据管理。张雅蕾：资源获取。范建伟：资金申请。沈峥：撰写——审稿与编辑、项目管理。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了政府间国际科技创新合作重点项目（项目编号：2022YFE0120600）、上海市科学技术委员会（项目编号：23DZ1203700）、贵州省科技项目（项目编号：KXJZ[2024]013）以及国家自然科学基金（项目编号：U21A20322）的支持。